Để xác định độ nhạy của quy trình, chúng tôi tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp mẫu DNA dương tính đã biết trước nồng độ ban đầu thành nhiều nồng độ khác nhau. Ở đây chúng tôi sử dụng nồng độ mẫu ban đầu là 2x107 bản sao/ml, sau đó pha loãng bậc 10 liên tiếp thành các nồng độ 2x106
, 2x105, 2x104, 2x103, 2x102, 2x101 bản sao/ml. Ở mỗi nồng độ, chúng tôi tiến hành khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được khảo sát từ các thí nghiệm trên, từ đó xác định nồng độ thấp nhất mà phương pháp vẫn cho kết quả rõ ràng và chính xác.
Sản phẩm PCR sau khi điện di cho kết quả như hình 16.
Hình 16: Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình
Trong đó:
Giếng 1: Thang DNA 100 bp
Giếng 2: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x107 bản sao/ml Giếng 3: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x106 bản sao/ml Giếng 4: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x105 bản sao/ml Giếng 5: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x104 bản sao/ml Giếng 6: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x103 bản sao/ml Giếng 7: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x102 bản sao/ml Giếng 8: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x101 bản sao/ml
400 bp
Với kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng: ở nồng độ mẫu là 104 - 107 vẫn có thể nhìn thấy rõ tín hiệu của các vạch, đến nồng độ 103 thì vạch sáng mờ đi nhiều và đến các nồng độ 102 trở về sau thì không còn thấy xuất hiện vạch sáng nữa.
Như vậy, chúng tôi có thể kết luận độ nhạy của phản ứng là 2x103 bản sao/ml. Với phương pháp phát hiện bệnh dựa trên kỹ thuật PCR và điện di để nhận biết thì việc có thể phát hiện mẫu bệnh có mang virus ở nồng độ 2x103 là khá nhạy.
3.3. Ứng dụng quy trình trên mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh
Ứng dụng quy trình trên với 30 mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh thu nhận từ các trại tôm nuôi ở Cam Ranh – Khánh Hòa, chúng tôi thu được kết quả như hình 17.
Hình 17: Kết quả ứng dụng quy trình trên mẫu nghi ngờ nhiễm bệnh IHHNV 1 2 3 4 5 6 T 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 T 22 23 24 25 26 27 28 29 30 300 bp 400 bp 400 bp 300 bp
- Giếng T : Thang DNA 100 bp.
- Giếng 1 – 30: DNA của 30 mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh.
Trong tổng số 30 mẫu tôm khảo sát, có 5 mẫu dương tính với IHHNV, chiếm tỷ lệ 16.67%. Điều đó chứng tỏ khả năng ứng dụng quy trình để phát hiện IHHNV trên tôm. Tuy nhiên, để kết quả này có độ tin cậy cao hơn, cần khảo sát thêm trên nhiều mẫu thu từ các vùng nuôi trọng điểm của cả nước để đánh giá tốt hơn khả năng ứng dụng của quy trình.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Đề tài về cơ bản đã hoàn thành mục tiêu đề ra, đó là:
- Xây dựng thành công quy trình phát hiện bệnh IHHNV trên tôm với độ nhạy là 2x103 bản sao/ml.
- Khảo sát khả năng ứng dụng của quy trình nhằm phát hiện IHHNV trên các mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh thu nhận từ các trại tôm nuôi ở Cam Ranh – Khánh Hòa (30 mẫu). Kết quả bước đầu cho thấy không xuất hiện các vạch ký sinh, chứng tỏ mồi thiết kế được có độ đặc hiệu cao.
Kiến nghị
Từ kết quả thu được ở trên, chúng tôi có một số kiến nghị sau:
- Tiếp tục khảo sát quy trình với số lượng mẫu lớn hơn, thu từ nhiều nguồn khác nhau, từ nhiều địa phương khác nhau (đặc biệt là từ các vùng nuôi tôm trọng điểm của cả nước) để có thể hoàn thiện hơn quy trình này. - Khảo sát độ đặc hiệu của mồi với một số chủng vi khuẩn khác có trong
nước cũng như vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản để chắc chắn mồi chỉ đặc hiệu với IHHNV.
- Khảo sát thêm một số điều kiện (quá trình xử lý - tách chiết DNA từ mẫu, các dung dịch đệm) để làm tăng độ nhạy của quy trình.
- So sánh kết quả với bộ Kit của các công ty khác để khẳng định khả năng ứng dụng của quy trình.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
[1] http://www.agriviet.com
[2] http://www.khoahocthuysan.org [3] http://www.mekongfish.net.vn
[4] Phạm Văn Hùng, Phạm Hùng Vân (2009). Virus gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu. Y học TP. Hồ Chí Minh *Tập 13* Phụ bản của số 2*2009.
[5] Phạm Văn Hùng, Nguyễn Tấn Bình, Nguyễn Đăng Ninh, Phạm Hùng Vân, Phạm Thành Hổ (2009). Sự phổ biến của virus gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan
tạo máu trên tôm sú nuôi tại Việt Nam. Y học TP. Hồ Chí Minh *Tập 13* Phụ bản của số 2*2009.
[6] Phan Đặng Thiên An, Phạm Văn Hùng, Hoàng Hiếu Ngọc, Phạm Hùng Vân (2009). Giải trình tự bộ gen infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV). Y học TP. Hồ Chí Minh *Tập 13* Phụ bản của số 2*2009.
Tài liệu Tiếng Anh
[7] Dhar A, Roux M, Klimpel K (2001).Detection and Quantification of Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus and White Spot Virus in Shrimp Using Real-Time Quantitative PCR and SYBR Green Chemistry. Journal Of Clinical Microbiology: 2835–2845
[8] Yang B, Song X, Huang J, Shi C, Liu L (2007). Evidence of existence of Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) in penaeid shrimp cultured in China.Veterinary Microbiology, 120: 63-70.
[9] Bui Thi Bich Hang (2007). Development of a monoclonal antibody assay for infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) of shrimp. Mahidol University: 13-26.
[10] Lightner D, Redman R, Bell T (1983). Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis, a Newly Recognized Virus Disease of Penaeid Shrimp.
Journal of Invertebrate pathology, 42: 62-70.
[11] Bonami J, Trumper B, Mari J, Brehelin M, Lightner D (1990). Purification and characterization of the infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus of penaeid shrimps. Journal of General Virology, 71: 2657-2664.
[12] Alvarez-Borrego J, Chávez-Sánchez M (2001). Detection of IHHN Virus in
shrimp tissue by digital color correlation. Aquaculture, 194: 1-9.
[13] Chayaburakul K, Lightner D, Sriurairattana S, Nelson K, Withyachumnarnkul B (2005). Different responses to Hypodermal and
Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV ) in Penaeus monodon and Penaeus vannamei. .Diseases of aqutic organisms – Dis Aquat Org, 67: 191-200.
[14] Tang K, Poulos B, Wang J, Redman R, Shih H, Lightner D (2003).
Geographic variations among infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) isolates and characteristics of their infection. Diseases of aqutic organisms – Dis Aquat Org, 53: 91-99.
[15] Tang K, Lightner D (2006). Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus ( IHHNV) – related sequences in the genome of the black tiger prawn Penaeus monodon from Africa and Australia. Virus Research, 118: 185-191.
[16] Tang K, Lightner D (2002). Low sequence variation among isolates of Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) originating from Hawaii and the Americas.Diseases of aqutic organisms – Dis Aquat Org, 49: 93-97.
[17] Nunan L, Poulos B, Lightner D (2000). Use of Polymerase Chain Reaction for the Detection of Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) in Penaeid Shrimp. Marine Biotechnology, 2: 319-328.
[18] Rai P, Pradeep B, Safeena M, Karunasagar I, Karunasagar I (2009).
Simultaneous presence of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) and Type A virus – related sequence in Penaeus monodon from India.
Aquaculture, 295: 168 – 174.
[19] Braz R, Reis C, Martins P, Sales M, Meissner R (2009). Prevalence of
infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in Penaeus vannamei cultured in northeastern Brazil. Aquaculture, 288: 143-146.
[20] Bell T, Lightner D (1984). IHHN Virus: Infectivity and pathogenicity studies in
Penaeus stylirostris and Penaeus vannamei. Aquaculture, 38: 185-194.
[21] Flegel T (2006). Detection of major Penaeid Shirmp viruses in Asia, a historical perspective with emphasis on Thailand. Aquaculture 258: 1-33.
[22] Saksmerprome V, Puiprom O, Noonin C, Flegel T (2010). Detection of Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) in farmed Australian Penaeus monodon by PCR analysis and DNA sequencing. Aquaculture, 298: 190-193.
[23] Villasante V, Puente M (1995). A review of viral diseases of cultured shrimp.
PHỤ LỤC
a) Mồi IHHNV318F
b) Mồi IHHNV318R
a) Mồi IHHNV318F
b) Mồi IHHNV318R