2.2.3.1. Nguyên tắc
Phản ứng PCR bao gồm một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ thường gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là 94 - 950C trong vòng 30 giây
– 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn, chính hai mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới.
Giai đoạn lai (hybridization): Trong bước này, nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của các mồi), cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng, dao động từ 40 – 700C, kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
Giai đoạn kéo dài (elongation): Tổng hợp mạch DNA mới nhờ sự hoạt động của DNA polymerase, nhiệt độ được tăng lên đến 720C, là nhiệt độ tối ưu cho Taq DNA polymerase hoạt động. Thời gian tổng hợp tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích sẽ được nhân bản thành hai bản sao, và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 – 40 lần thì từ một DNA đích sẽ được nhân bản thành 230
- 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.
2.2.3.2. Các thành phần trong phản ứng PCR
a) Enzyme
Ngày nay có rất nhiều polymerase chịu nhiệt khác nhau đã được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn.
Taq polymerase – một DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối nước nóng – Thermus aquaticus. Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng.
b) Dung dịch đệm (PCR buffer)
Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (inonic strength) cần thiết cho phản ứng xảy ra, tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR. Nồng độ, pH của dung dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu thường tùy thuộc vào nguồn DNA polymerase sử dụng, không có một quy luật chung cho vấn đề này.
c) MgCl2
Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Mg2+ là Co–factor của Taq polymerase
nên nếu lượng Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài, hạn chế quá trình kéo dài. Ngược lại, nếu nồng độ quá cao dễ gây khuếch đại ký sinh. Do đó, nồng độ MgCl2 sử dụng cần được tối ưu hóa cho từng hệ thống PCR cụ thể. Thông thường, MgCl2 được sử dụng ở nồng độ từ 1,5 mM – 4 mM.
d) Nồng độ các dNTP (deoxynucleotide triphotphat)
Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20 – 200 µM/mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”, làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR, còn sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase.
e) Mồi
Mồi là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng PCR. Do đó, công việc thiết kế mồi sẽ đóng vai trò then chốt quyết định sự thành công của quy trình PCR.
f) DNA mạch khuôn
Phản ứng PCR cần lượng DNA ban đầu đưa vào thường không quá cao, thậm chí chỉ cần một phân tử DNA ban đầu cho một phản ứng. Tuy nhiên, nồng độ DNA tốt nhất sử dụng trong phản ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/ phản ứng.
2.2.3.3. Các bƣớc tiến hành
Phản ứng PCR được thực hiện có thể tích 25 µl bao gồm: 20 µl mix PCR (Bảng 3) + 5 µl dịch DNA tách chiết (hoặc 5 µl nước cất đối với chứng âm), cho vào eppendorf 0,2 ml. Pha mix PCR theo bảng sau:
Bảng 3: Cách pha mix PCR Hóa chất Thể tích cho 1 eppendorf (µl) Thể tích cho 55 eppendorf (µl) Master mix 12,5 687,5 Mồi IHHNV318F/R 0,5 27,5 Nước cất 2 lần 7 385
, b
mix cho các eppendorf (20 μ eppendorf 0,2 ml). Cho thêm 5 μl dịch chiết DNA từ tôm vào. Đối với eppendorf làm chứng dương, dịch chiết DNA từ tôm đã biết trước bệnh. Đối với chứng âm, ta cho vào 5 μl nước cất.
Ly tâm nhẹ để dung dịch bám trên thành rơi hết xuống đáy eppendorf.
Đem eppendorf đặt .
Đặt chương trình cho máy luân nhiệt hoạt động. Phản ứng được tiến hành với chu kỳ nhiệt như sau:
o Chu kỳ 1: 950C 15 phút o Chu kỳ 2: 940C 30 giây 550C 30 giây 720C 30 giây o Chu kỳ 3: 720C 3 phút o Kết thúc ở - 40 .
2.2.4. Điện di trên gel agarose 2.2.4.1. Nguyên tắc
Dựa trên đặc tính cấu trúc của các nucleic acid, là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về phía cực dương.
Điện di gel agarose là phương pháp thông dụng dùng để tách rời các đoạn nucleic acid có kích thước trong khoảng 0,5 – 20 kb.
Phương pháp điện di được sử dụng cả trong phân tích định tính lẫn trong việc thu nhận mẫu nucleic acid sau phản ứng PCR.
2.2.4.2. Các bƣớc tiến hành
- Pha loãng dung dịch điện di 50X với nước cất thành 1X để sử dụng. Chuẩn bị khuôn gel có gắn lược.
- Gel agarose 3%: Cân 3 g agarose hòa tan cùng dung dịch TAE 1X cho đủ 100 ml. Đun cho tan agarose hoàn toàn, lắc nhẹ nhàng (tránh tạo bọt khí khi lắc) đến khi nguội xuống 600
C. Đổ gel vào khuôn đã chuẩn bị. Chờ đến khi gel đông đặc, lấy gel ra khỏi khuôn, gỡ bỏ lược, bảo quản trong hộp kín có chứa TAE 1X và giữ ở 40C đến khi sử dụng. Gel này phải qua bước nhuộm Ethidium bromide sau điện di.
- Chuẩn bị gel agarose để chạy điện di có số giếng bằng với số mẫu chạy PCR, thêm một giếng cho thang DNA. Cho 3 µl dung dịch nạp mẫu và 7 µl sản phẩm PCR của mỗi mẫu (hoặc 1 µl thang chuẩn), trộn đều, nạp hết vào giếng.
- Chạy điện di ở 50 V trong 5-10 phút. Sau đó tăng lên 75-80 V trong 25-30 phút.
- Sau khi ngưng quá trình chạy điện di, tắt máy và lấy gel ra khỏi bể điện di, ngâm vào dung dịch ethidium bromide, để trong tối trong vòng 30 phút. Sau đó chuyển gel lên bàn đèn tử ngoại. Các vạch DNA sẽ xuất hiện với màu đỏ cam. Ghi nhận kết quả so với thang chuẩn. Chụp hình giữ kết quả.
2.2.5. Thiết kế mồi cho phản ứng PCR 2.2.5.1. Các tiêu chuẩn thiết kế mồi 2.2.5.1. Các tiêu chuẩn thiết kế mồi
Trong phương pháp PCR, mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn mang tính quyết định của quy trình có phương pháp PCR.
Việc lựa chọn mồi cần tuân thủ theo một số nguyên tắc sau: - Mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại. - Bắt cặp đặc hiệu với ít nhất 70% chiều dài DNA.
- 5 nucleotide đầu tiên của mồi phải bắt cặp hoàn toàn với trình tự nucleotide mục tiêu.
- Thành phần GC lý tưởng của đoạn mồi nằm trong khoảng 40 – 60% để nhiệt độ bắt cặp của mồi là không quá thấp.
- Tránh lặp lại các cặp GC nhiều lần, dễ tạo ra các khuếch đại ký sinh do bắt cặp với các trình tự khác, dẫn đến việc tổng hợp không chính xác.
- Thành phần nucleotide của mồi phải cân bằng.
- Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không nên cách nhau quá xa, vì nếu chênh lệch nhiệt độ lớn thì mồi có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn mồi có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với DNA.
- Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược, cũng như không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự tái bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của mồi.
- Thành phần 5 nucleotide cuối cùng trong đầu 3’ không nên có hơn hai G hoặc C nhằm tránh hiện tượng nhân bản ký sinh trong phản ứng PCR.
- Trình tự nằm giữa 2 mồi “xuôi” và “ngược” không quá lớn; phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb.
2.2.5.2. Phƣơng pháp đánh giá mồi
Các thông số của mồi được kiểm tra bằng các phần mềm Annhyb, Oligo Analyzer, ClustalX 2.0.12, BioEdit, chương trình BLAST trên NCBI, cùng các trình tự genenome IHHNV được tải về từ Genebank, cặp mồi sẽ được kiểm tra trên lý thuyết nhằm đảm bảo các yêu cầu về kích thước, % GC, nhiệt độ biến tính, các cấu trúc thứ cấp (cấu trúc kẹp tóc, các dimer), khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi, trước khi được ứng dụng vào thực nghiệm.
2.2.5.3. Phƣơng pháp xác định nhiệt độ lai tối ƣu của mồi (Ta)
Nhiệt độ lai là một chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng lớn đến kết quả của phản ứng PCR. Nhiệt độ lai quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng không tốt đến hiệu quả nhân bản của phản ứng: nếu nhiệt độ lai quá thấp so với nhiệt độ biến tính của cặp mồi sử dụng dễ tạo ra các sản phẩm ký sinh không mong muốn, còn nhiệt độ lai quá cao sẽ cản trở sự bắt cặp của mồi vào DNA bản mẫu, do đó, hiệu quả của phản ứng không tốt.
Từ nhiệt độ biến tính của mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng, tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho phản ứng. Thông thường nhiệt độ lai được tính theo công thức:
Ta = (Tm primerF + Tm primerR)/2 ± 50C
Do đó, để xác định nhiệt độ lai tối ưu của mồi, sẽ tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho cặp mồi IHHNV318F và IHHNV318R trên một gradient nhiệt độ từ 500C đến 600C. Trừ sự thay đổi về nhiệt độ lai, các thành phần khác và các điều kiện của phản ứng đều được giữ nguyên và đồng nhất. Sau đó tiến hành phân tích kết quả để chọn ra nhiệt độ lai tối ưu nhất cho cả quy trình.
2.2.5.4. Phƣơng pháp xác định độ đặc hiệu của mồi
Một yêu cầu quan trọng của mồi là nó phải khuếch đại đúng trình tự mục tiêu cần quan tâm. Ngoài trình tự mục tiêu của loài đang khảo sát, mồi không được bắt cặp lên các trình tự của loài khác. Do đó, việc xác định độ đặc hiệu của mồi luôn luôn được đòi hỏi.
Việc xác định này phải được thực hiện trên cả lý thuyết và thực nghiệm bằng cách khảo sát khả năng bắt cặp của mồi lên các trình tự của các virus khác và các vi khuẩn cũng gây bệnh cho tôm, cũng như các loại vi khuẩn tồn tại trong môi trường nuôi.
2.2.5.5. Phƣơng pháp xác định độ nhạy của quy trình
Với bất kỳ phương pháp nào, các đối tượng mục tiêu cũng chỉ có thể được phát hiện ở một nồng độ giới hạn của chúng trong mẫu. Một phương pháp tốt khi nó có thể phát hiện được đối tượng quan tâm ở nồng độ càng thấp càng tốt. Do đó, đây là một chỉ tiêu quan trọng dùng để đánh giá mức độ hiệu quả của phương pháp.
Trong nghiên cứu này, để xác định độ nhạy của mồi, chúng tôi tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp mẫu ban đầu thành nhiều nồng độ khác nhau. Ở một nồng độ sẽ được khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được xác định từ các thí nghiệm trên. Từ đó độ nhạy của quy trình được xác định, đây chính là nồng độ khuôn DNA thấp nhất nhưng vẫn cho kết quả rõ rang và chính xác.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết DNA
DNA virus từ tôm được tách chiết nhờ sử dụng bộ Kit tách chiết DNA của Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á. Vì số lượng và chất lượng của DNA ảnh hưởng đến phản ứng PCR nên việc kiểm tra độ tinh sạch của DNA là điều cần thiết. Chúng tôi sử dụng phương pháp đo quang phổ (OD) để xác định nồng độ DNA dựa vào độ hấp thụ tia UV ở bước sóng 260 nm. Kết quả:
Tỷ lệ: OD260/OD280 = 1,7 – 2.0
Như vậy, DNA được tách chiết theo quy trình trên đảm bảo độ tinh sạch, đủ điều kiện để chạy phản ứng PCR mà không làm ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng.
3.2. Xây dựng quy trình PCR chẩn đoán bệnh IHHNV
3.2.1. Thiết kế mồi và kiểm tra các đặc tính của mồi trên lý thuyết 3.2.1.1. Thiết kế mồi
Cặp mồi 318F/R được thiết kế để khuếch đại đoạn trình tự có kích thước 318 bp trên genihhnvgp2 nằm trong vùng ORF1 của IHHNV, dựa trên các cặp mồi tham khảo (Bảng 4).
3.2.1.2. Các thông số của mồi
Các đặc tính của mồi bao gồm: kích thước, nhiệt độ biến tính, tỷ lệ GC, cấu trúc thứ cấp… được kiểm tra bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 (http://www.idtdna.com). Kết quả được trình bày trong bảng 5.
Bảng 4: Các cặp mồi tham khảo để thiết kế cặp mồi IHHNV318F/R
Bảng 5: Một số đặc tính của cặp mồi IHHNV 318F/R
Tên mồi Độ dài Nhiệt độ biến tính (Tm, 0C) Thành phần GC (%) Self-dimer G (kcal/mol) Hetero- dimer G (kcal/mol) IHHNV318F 25 54.8 40.0 - 7.43 - 3.54 IHHNV318R 24 55.5 45.8 - 4.74 - 3.54
Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy rằng:
Về kích thước: cặp mồi có chiều dài đạt yêu cầu (18 – 25 bp), cho phép khả năng nhân bản tốt nhất.
Về nhiệt độ biến tính: sự chênh lệch nhiệt độ biến tính giữa mồi xuôi và mồi ngược không lớn, dao động trong khoảng cho phép, đảm bảo cho khả năng bắt cặp tốt nhất của chúng trong cùng điều kiện nhiệt độ.
Về thành phần GC: do đoạn gen khảo sát nằm trong vùng có % GC không cao nên tỷ lệ GC của cặp mồi IHHNV318F/R cũng không cao, tuy nhiên, vẫn nằm trong khoảng tỷ lệ tốt nhất cho sự khuếch đại của mồi (40 – 60%).
Tên mồi Trình tự Độ dài sản phẩm (bp) Nhiệt độ biến tính (0C) IHHNV309F IHHNV309R IHHNV389F IHHNV389R MG831F MG831R IHHNV648F IHHNV648R IHHNV318F IHHNV318R 5′-TCCAACACTTAGTCAAAACCAA-3′ 5′-TGTCTGCTACGATGATTATCCA-3′ 5′-CGGAACACAACCCGACTTTA-3′ 5′-GGCCAAGACCAAAATACGAA-3′ 5′-TTGGGGATGCAGCAATATCT-3′ 5′-GTCCATCCACTGATCGGACT-3′ 5′-GAACGGCTTTCGTATTTTGG-3′ 5′-AGCGTAGGACTTGCCGATTA-3′ 5’- TATGACTACCTCCAACACTTAGTCA -3’ 5’- GTCTGCTACGATGATTATCCAAGC -3’ 309 389 831 648 318 52.4 53.3 55.1 53.2 54.2 56.3 52.2 56 54.8 55.5
Kết quả kiểm tra sự tạo thành cấu trúc thứ cấp của các mồi cho thấy:
Các mồi đều có sự hình thành cấu trúc cặp tóc (hairpin) và cấu trúc tự mồi (self-dimer). Tuy nhiên, các cấu trúc này đều có năng lượng tự do G lớn hơn – 9 kcal/mol (thường thì các cấu trúc thứ cấp có G lớn hơn – 9 kcal/mol sẽ không gây ảnh hưởng đến hoạt động của mồi) như kết quả hình 7 và hình 8.
a. IHHNV 318F b. IHHNV 318R
Hình 7: Cấu trúc kẹp tóc của mồi
Về cấu trúc hetero-dimer: qua khảo sát cũng nhận thấy mồi xuôi và mồi ngược có sự hình thành cấu trúc hetero-dimer với nhau, tuy nhiên, tất cả các cấu trúc này đều có G lớn hơn – 9 kcal/mol (Hình 9).
a. IHHNV318F b. IHHNV318R
Hình 9: Một số cấu trúc hetero-dimer của mồi
Ở đây, chúng tôi chỉ minh họa một số cấu trúc thứ cấp, nhiều cấu trúc khác ở được trình bày trong phần phụ lục.
3.2.1.3. Tính đặc hiệu của mồi
Song song với việc kiểm tra các đặc tính của mồi, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát khả năng nhân bản chọn lọc cũng như độ đặc hiệu của mồi trên lý thuyết.
Để khảo sát các yếu tố này, chúng tôi tiến hành BLAST từng trình tự mồi lên ngân hàng cơ sở dữ liệu Genebank của NCBI để tìm kiếm các trình tự tương đồng với trình tự này, sắp gióng các mồi với những trình tự chuẩn bằng phần mềm ClustalX và BioEdit, cũng như khảo sát khả năng bắt cặp của mồi lên trình tự mục tiêu thông qua phần mềm Anhyb.
Sau khi khảo sát, chúng tôi nhận thấy, các mồi bắt cặp 100% với các trình tự