Để kiểm tra sự hoạt động của mồi sau khi tổng hợp, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR rồi mang sản phẩm đi điện di nhằm kiểm tra sự bắt cặp của mồi IHHNV318F và IHHNV318R lên trình tự cần quan tâm (hình 13).
Chúng tôi đặt 4 phản ứng, gồm có: - 1 chứng dương bệnh IHHNV - 1 chứng âm
- 1 mẫu tôm đã biết nhiễm bệnh IHHNV - 1 mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh IHHNV
Kết quả thu nhận được như sau.
Hình 13:Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của mồi
Giếng T: Thang DNA 100 bp
Giếng 1: Mẫu đã biết trước nhiễm bệnh IHHNV
Giếng 2: Mẫu chứng dương IHHNV được cung cấp bởi TTCNSH TPHCM Giếng 3: Mẫu tôm nghi ngờ mang bệnh IHHNV
Giếng 4: Chứng âm Qua kết quả trên cho thấy:
- Ở giếng thứ 4, chứng âm không xuất hiện band DNA quan tâm, do vậy có thể kết luận, quá trình tách chiết và đặt phản ứng PCR không bị ngoại nhiễm. - Ở giếng thứ 2, chứng dương IHHNV không xuất hiện band DNA có kích thước 318 bp nên kết luận chứng dương không tốt. Do vậy, mẫu chứng dương này không được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo.
- Ở giếng thứ nhất, mẫu mang bệnh IHHNV thể hiện dương tính mạnh, có vạch sản phẩm sáng rõ ở vị trí khoảng 320 bp so với thang chuẩn DNA 100 bp, do vậy mẫu tôm mang bệnh IHHNV được sử dụng làm chứng dương cho các phản ứng sau.
- Ở giếng thứ 3, mẫu nghi ngờ không xuất hiện vạch sáng nào, chứng tỏ mẫu tôm ban đầu không bị nhiễm IHHNV.
T 1 2 3 4
400 bp
1 2 3 4 T 5 6 7 8
Như vậy, trên thực nghiệm, cặp mồi 318F/R có khả năng bắt cặp tốt với trình tự DNA của virus IHHNV và nhân bản để tạo thành sản phẩm có kích thước khoảng 320 bp, đúng với kết quả dự kiến ban đầu.
Để khẳng định band DNA thu được đúng là trình tự của IHHNV, sản phẩm PCR thu được ở trên được giải trình tự để kiểm tra. Sau khi giải trình tự, kết quả thu được sẽ được so sánh với các trình tự chuẩn công bố trên Genebank bằng phần mềm ClustalX. Đồng thời chúng tôi cũng sử dụng chương trình BLAST trên NCBI để tìm kiếm các trình tự tương đồng với đoạn trình tự mà chúng tôi khuếch đại được. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR hoàn toàn tương đồng với các trình tự tải về từ Genebank (Kết quả không được nêu ở đây).
Với kết quả này, chúng tôi có thể khẳng định rằng cặp mồi được sử dụng đã nhân bản đúng trình tự mục tiêu, tạo ra sản phẩm có kích thước đúng 318 bp.