2.2.5.1. Các tiêu chuẩn thiết kế mồi
Trong phương pháp PCR, mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn mang tính quyết định của quy trình có phương pháp PCR.
Việc lựa chọn mồi cần tuân thủ theo một số nguyên tắc sau: - Mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại. - Bắt cặp đặc hiệu với ít nhất 70% chiều dài DNA.
- 5 nucleotide đầu tiên của mồi phải bắt cặp hoàn toàn với trình tự nucleotide mục tiêu.
- Thành phần GC lý tưởng của đoạn mồi nằm trong khoảng 40 – 60% để nhiệt độ bắt cặp của mồi là không quá thấp.
- Tránh lặp lại các cặp GC nhiều lần, dễ tạo ra các khuếch đại ký sinh do bắt cặp với các trình tự khác, dẫn đến việc tổng hợp không chính xác.
- Thành phần nucleotide của mồi phải cân bằng.
- Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không nên cách nhau quá xa, vì nếu chênh lệch nhiệt độ lớn thì mồi có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn mồi có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với DNA.
- Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược, cũng như không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự tái bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của mồi.
- Thành phần 5 nucleotide cuối cùng trong đầu 3’ không nên có hơn hai G hoặc C nhằm tránh hiện tượng nhân bản ký sinh trong phản ứng PCR.
- Trình tự nằm giữa 2 mồi “xuôi” và “ngược” không quá lớn; phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb.
2.2.5.2. Phƣơng pháp đánh giá mồi
Các thông số của mồi được kiểm tra bằng các phần mềm Annhyb, Oligo Analyzer, ClustalX 2.0.12, BioEdit, chương trình BLAST trên NCBI, cùng các trình tự genenome IHHNV được tải về từ Genebank, cặp mồi sẽ được kiểm tra trên lý thuyết nhằm đảm bảo các yêu cầu về kích thước, % GC, nhiệt độ biến tính, các cấu trúc thứ cấp (cấu trúc kẹp tóc, các dimer), khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi, trước khi được ứng dụng vào thực nghiệm.
2.2.5.3. Phƣơng pháp xác định nhiệt độ lai tối ƣu của mồi (Ta)
Nhiệt độ lai là một chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng lớn đến kết quả của phản ứng PCR. Nhiệt độ lai quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng không tốt đến hiệu quả nhân bản của phản ứng: nếu nhiệt độ lai quá thấp so với nhiệt độ biến tính của cặp mồi sử dụng dễ tạo ra các sản phẩm ký sinh không mong muốn, còn nhiệt độ lai quá cao sẽ cản trở sự bắt cặp của mồi vào DNA bản mẫu, do đó, hiệu quả của phản ứng không tốt.
Từ nhiệt độ biến tính của mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng, tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho phản ứng. Thông thường nhiệt độ lai được tính theo công thức:
Ta = (Tm primerF + Tm primerR)/2 ± 50C
Do đó, để xác định nhiệt độ lai tối ưu của mồi, sẽ tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho cặp mồi IHHNV318F và IHHNV318R trên một gradient nhiệt độ từ 500C đến 600C. Trừ sự thay đổi về nhiệt độ lai, các thành phần khác và các điều kiện của phản ứng đều được giữ nguyên và đồng nhất. Sau đó tiến hành phân tích kết quả để chọn ra nhiệt độ lai tối ưu nhất cho cả quy trình.
2.2.5.4. Phƣơng pháp xác định độ đặc hiệu của mồi
Một yêu cầu quan trọng của mồi là nó phải khuếch đại đúng trình tự mục tiêu cần quan tâm. Ngoài trình tự mục tiêu của loài đang khảo sát, mồi không được bắt cặp lên các trình tự của loài khác. Do đó, việc xác định độ đặc hiệu của mồi luôn luôn được đòi hỏi.
Việc xác định này phải được thực hiện trên cả lý thuyết và thực nghiệm bằng cách khảo sát khả năng bắt cặp của mồi lên các trình tự của các virus khác và các vi khuẩn cũng gây bệnh cho tôm, cũng như các loại vi khuẩn tồn tại trong môi trường nuôi.
2.2.5.5. Phƣơng pháp xác định độ nhạy của quy trình
Với bất kỳ phương pháp nào, các đối tượng mục tiêu cũng chỉ có thể được phát hiện ở một nồng độ giới hạn của chúng trong mẫu. Một phương pháp tốt khi nó có thể phát hiện được đối tượng quan tâm ở nồng độ càng thấp càng tốt. Do đó, đây là một chỉ tiêu quan trọng dùng để đánh giá mức độ hiệu quả của phương pháp.
Trong nghiên cứu này, để xác định độ nhạy của mồi, chúng tôi tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp mẫu ban đầu thành nhiều nồng độ khác nhau. Ở một nồng độ sẽ được khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được xác định từ các thí nghiệm trên. Từ đó độ nhạy của quy trình được xác định, đây chính là nồng độ khuôn DNA thấp nhất nhưng vẫn cho kết quả rõ rang và chính xác.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết DNA
DNA virus từ tôm được tách chiết nhờ sử dụng bộ Kit tách chiết DNA của Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á. Vì số lượng và chất lượng của DNA ảnh hưởng đến phản ứng PCR nên việc kiểm tra độ tinh sạch của DNA là điều cần thiết. Chúng tôi sử dụng phương pháp đo quang phổ (OD) để xác định nồng độ DNA dựa vào độ hấp thụ tia UV ở bước sóng 260 nm. Kết quả:
Tỷ lệ: OD260/OD280 = 1,7 – 2.0
Như vậy, DNA được tách chiết theo quy trình trên đảm bảo độ tinh sạch, đủ điều kiện để chạy phản ứng PCR mà không làm ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng.