3.2.1. Thiết kế mồi và kiểm tra các đặc tính của mồi trên lý thuyết 3.2.1.1. Thiết kế mồi
Cặp mồi 318F/R được thiết kế để khuếch đại đoạn trình tự có kích thước 318 bp trên genihhnvgp2 nằm trong vùng ORF1 của IHHNV, dựa trên các cặp mồi tham khảo (Bảng 4).
3.2.1.2. Các thông số của mồi
Các đặc tính của mồi bao gồm: kích thước, nhiệt độ biến tính, tỷ lệ GC, cấu trúc thứ cấp… được kiểm tra bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 (http://www.idtdna.com). Kết quả được trình bày trong bảng 5.
Bảng 4: Các cặp mồi tham khảo để thiết kế cặp mồi IHHNV318F/R
Bảng 5: Một số đặc tính của cặp mồi IHHNV 318F/R
Tên mồi Độ dài Nhiệt độ biến tính (Tm, 0C) Thành phần GC (%) Self-dimer G (kcal/mol) Hetero- dimer G (kcal/mol) IHHNV318F 25 54.8 40.0 - 7.43 - 3.54 IHHNV318R 24 55.5 45.8 - 4.74 - 3.54
Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy rằng:
Về kích thước: cặp mồi có chiều dài đạt yêu cầu (18 – 25 bp), cho phép khả năng nhân bản tốt nhất.
Về nhiệt độ biến tính: sự chênh lệch nhiệt độ biến tính giữa mồi xuôi và mồi ngược không lớn, dao động trong khoảng cho phép, đảm bảo cho khả năng bắt cặp tốt nhất của chúng trong cùng điều kiện nhiệt độ.
Về thành phần GC: do đoạn gen khảo sát nằm trong vùng có % GC không cao nên tỷ lệ GC của cặp mồi IHHNV318F/R cũng không cao, tuy nhiên, vẫn nằm trong khoảng tỷ lệ tốt nhất cho sự khuếch đại của mồi (40 – 60%).
Tên mồi Trình tự Độ dài sản phẩm (bp) Nhiệt độ biến tính (0C) IHHNV309F IHHNV309R IHHNV389F IHHNV389R MG831F MG831R IHHNV648F IHHNV648R IHHNV318F IHHNV318R 5′-TCCAACACTTAGTCAAAACCAA-3′ 5′-TGTCTGCTACGATGATTATCCA-3′ 5′-CGGAACACAACCCGACTTTA-3′ 5′-GGCCAAGACCAAAATACGAA-3′ 5′-TTGGGGATGCAGCAATATCT-3′ 5′-GTCCATCCACTGATCGGACT-3′ 5′-GAACGGCTTTCGTATTTTGG-3′ 5′-AGCGTAGGACTTGCCGATTA-3′ 5’- TATGACTACCTCCAACACTTAGTCA -3’ 5’- GTCTGCTACGATGATTATCCAAGC -3’ 309 389 831 648 318 52.4 53.3 55.1 53.2 54.2 56.3 52.2 56 54.8 55.5
Kết quả kiểm tra sự tạo thành cấu trúc thứ cấp của các mồi cho thấy:
Các mồi đều có sự hình thành cấu trúc cặp tóc (hairpin) và cấu trúc tự mồi (self-dimer). Tuy nhiên, các cấu trúc này đều có năng lượng tự do G lớn hơn – 9 kcal/mol (thường thì các cấu trúc thứ cấp có G lớn hơn – 9 kcal/mol sẽ không gây ảnh hưởng đến hoạt động của mồi) như kết quả hình 7 và hình 8.
a. IHHNV 318F b. IHHNV 318R
Hình 7: Cấu trúc kẹp tóc của mồi
Về cấu trúc hetero-dimer: qua khảo sát cũng nhận thấy mồi xuôi và mồi ngược có sự hình thành cấu trúc hetero-dimer với nhau, tuy nhiên, tất cả các cấu trúc này đều có G lớn hơn – 9 kcal/mol (Hình 9).
a. IHHNV318F b. IHHNV318R
Hình 9: Một số cấu trúc hetero-dimer của mồi
Ở đây, chúng tôi chỉ minh họa một số cấu trúc thứ cấp, nhiều cấu trúc khác ở được trình bày trong phần phụ lục.
3.2.1.3. Tính đặc hiệu của mồi
Song song với việc kiểm tra các đặc tính của mồi, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát khả năng nhân bản chọn lọc cũng như độ đặc hiệu của mồi trên lý thuyết.
Để khảo sát các yếu tố này, chúng tôi tiến hành BLAST từng trình tự mồi lên ngân hàng cơ sở dữ liệu Genebank của NCBI để tìm kiếm các trình tự tương đồng với trình tự này, sắp gióng các mồi với những trình tự chuẩn bằng phần mềm ClustalX và BioEdit, cũng như khảo sát khả năng bắt cặp của mồi lên trình tự mục tiêu thông qua phần mềm Anhyb.
Sau khi khảo sát, chúng tôi nhận thấy, các mồi bắt cặp 100% với các trình tự IHHNV. Đối với các loài khác, % bắt cặp không cao (≤ 75%), đồng thời, các giá trị E- value cũng khá lớn, thể hiện mức độ tin cậy thấp (Hình 10).
Giá trị E-value là một thông số thể hiện mức độ tin cậy về sự tương đồng giữa hai trình tự. Giá trị này càng nhỏ hoặc bằng 0 thì sự tương đồng giữa các trình tự càng có ý nghĩa.
a. IHHNV318F
b. IHHNV318R
Hơn thế nữa, vị trí bắt cặp của các mồi có độ bảo tồn cao với các trình tự IHHNV gây nhiễm (đến 100%), không bắt cặp được với trình tự tương đồng trên genome của tôm sú (Hình 11).
a. IHHNV 318F (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
b. IHHNV 318R
Hình 11:Kết quả sắp gióng mồi xuôi và mồi ngƣợc với các trình tự tải về từ Genebank bằng phần mềm BioEdit
Khi khảo sát trên Anhyb thì chúng tôi nhận thấy các mồi bắt cặp hoàn toàn với các trình tự mục tiêu (với score là 100), và đều cho ra sản phẩm khuếch đại với kích
thước đúng theo lý thuyết. Việc bắt cặp ở các vị trí khác nếu có đều có score dưới 50 (Hình 12).
Hình 12: Kết quả kiểm tra mồi xuôi và mồi ngƣợc bằng phần mềm Anhyb
Từ kết quả trên chúng tôi có thể kết luận, trên lý thuyết cặp mồi có thể nhân bản đúng trình tự đích và có độ đặc hiệu cao.
3.2.2. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện của phản ứng PCR ứng PCR
3.2.2.1. Sự hoạt động của mồi trên thực tế
Để kiểm tra sự hoạt động của mồi sau khi tổng hợp, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR rồi mang sản phẩm đi điện di nhằm kiểm tra sự bắt cặp của mồi IHHNV318F và IHHNV318R lên trình tự cần quan tâm (hình 13).
Chúng tôi đặt 4 phản ứng, gồm có: - 1 chứng dương bệnh IHHNV - 1 chứng âm
- 1 mẫu tôm đã biết nhiễm bệnh IHHNV - 1 mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh IHHNV
Kết quả thu nhận được như sau.
Hình 13:Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của mồi
Giếng T: Thang DNA 100 bp
Giếng 1: Mẫu đã biết trước nhiễm bệnh IHHNV
Giếng 2: Mẫu chứng dương IHHNV được cung cấp bởi TTCNSH TPHCM Giếng 3: Mẫu tôm nghi ngờ mang bệnh IHHNV
Giếng 4: Chứng âm Qua kết quả trên cho thấy:
- Ở giếng thứ 4, chứng âm không xuất hiện band DNA quan tâm, do vậy có thể kết luận, quá trình tách chiết và đặt phản ứng PCR không bị ngoại nhiễm. - Ở giếng thứ 2, chứng dương IHHNV không xuất hiện band DNA có kích thước 318 bp nên kết luận chứng dương không tốt. Do vậy, mẫu chứng dương này không được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo.
- Ở giếng thứ nhất, mẫu mang bệnh IHHNV thể hiện dương tính mạnh, có vạch sản phẩm sáng rõ ở vị trí khoảng 320 bp so với thang chuẩn DNA 100 bp, do vậy mẫu tôm mang bệnh IHHNV được sử dụng làm chứng dương cho các phản ứng sau.
- Ở giếng thứ 3, mẫu nghi ngờ không xuất hiện vạch sáng nào, chứng tỏ mẫu tôm ban đầu không bị nhiễm IHHNV.
T 1 2 3 4
400 bp
1 2 3 4 T 5 6 7 8
Như vậy, trên thực nghiệm, cặp mồi 318F/R có khả năng bắt cặp tốt với trình tự DNA của virus IHHNV và nhân bản để tạo thành sản phẩm có kích thước khoảng 320 bp, đúng với kết quả dự kiến ban đầu.
Để khẳng định band DNA thu được đúng là trình tự của IHHNV, sản phẩm PCR thu được ở trên được giải trình tự để kiểm tra. Sau khi giải trình tự, kết quả thu được sẽ được so sánh với các trình tự chuẩn công bố trên Genebank bằng phần mềm ClustalX. Đồng thời chúng tôi cũng sử dụng chương trình BLAST trên NCBI để tìm kiếm các trình tự tương đồng với đoạn trình tự mà chúng tôi khuếch đại được. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR hoàn toàn tương đồng với các trình tự tải về từ Genebank (Kết quả không được nêu ở đây).
Với kết quả này, chúng tôi có thể khẳng định rằng cặp mồi được sử dụng đã nhân bản đúng trình tự mục tiêu, tạo ra sản phẩm có kích thước đúng 318 bp.
3.2.2.2. Nhiệt độ lai
Nhiệt độ lai là một yếu tố rất quan trọng của phản ứng PCR. Để khảo sát nhiệt độ lai thích hợp cho quy trình, chúng tôi thực hiện 8 phản ứng (với chứng dương là mẫu DNA tách chiết từ tôm đã biết trước có bệnh) và thiết lập 1 gradient nhiệt độ cho mồi IHHNV318 từ 500C đến 600C. Trừ sự thay đổi về nhiệt độ lai, các thành phần khác và các điều kiện của phản ứng đều được giữ nguyên và đồng nhất. Sau khi phản ứng PCR hoàn thành, sản phẩm PCR được điện di rồi đọc kết quả (Hình 14).
Hình 14: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của mồi IHHNV318F/R
300 bp 400 bp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó: Giếng 1: 500C Giếng 2: 50,70C Giếng 3: 520C Giếng 4: 53,70C Giếng 5: 56,20C Giếng 6: 58,10C Giếng 7: 59,30C Giếng 8: 600C
Giếng T: Thang DNA 100 bp
Ở tất cả các nhiệt độ trên đều xuất hiện rõ vạch 318 bp, ngay cả ở nhiệt độ 500C và 600C, và không xuất hiện vạch ký sinh nào. Trong đó, ở khoảng nhiệt độ 53,70C, 56,20C, 58,10C thì các vạch xuất hiện sáng rõ nhất. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ lai tối ưu cho quy trình là 550C, giống các công trình nghiên cứu đã công bố[18, 22]
.
3.2.2.3. Độ đặc hiệu của mồi
Chúng tôi đặt 8 phản ứng PCR với: - 1 mẫu DNA IHHNV dương tính - 1 chứng âm
- 3 chứng dương của các bệnh trên tôm do các virus khác gây ra bao gồm: WSSV, MBV, HPV để kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi IHHNV318F/R với trình tự virus quan tâm.
- 3 chứng dương : WSSV, MBV, HPV chạy với mồi thiết kế cho từng loài virus
Hình 15: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của mồi IHHNV318F/R
Trong đó:
Giếng 1: Mẫu chứng dương bệnh IHHNV Giếng 2: Chứng âm
Giếng T: Thang DNA 100 bp
Giếng 3: Mẫu chứng dương bệnh WSSV với mồi IHHNV Giếng 4: Mẫu chứng dương bệnh WSSV với mồi WSSV Giếng 5: Mẫu chứng dượng bệnh HPV với mồi IHHNV Giếng 6: Mẫu chứng dương bệnh HPV với mồi HPV Giếng 7: Mẫu chứng dương bệnh MBV với mồi IHHNV Giếng 8: Mẫu chứng dương bệnh MBV với mồi MBV
Từ hình 17 cho thấy, cặp mồi IHHNV318 chỉ bắt cặp với trình tự DNA của IHHNV mà không bắt cặp với DNA của các virus gây bệnh khác. Sản phẩm khuếch đại đặc trưng là các đoạn DNA có kích thước 318 bp sau quá trình điện di được so với thang DNA chuẩn.
Vậy, từ kết quả trên chúng tôi kết luận, cặp mồi IHHNV318F/R đặc hiệu để phát hiện tác nhân gây bệnh IHHNV.
1 2 T 3 4 5 6 7 8
300 bp
3.2.2.4. Độ nhạy của quy trình
Để xác định độ nhạy của quy trình, chúng tôi tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp mẫu DNA dương tính đã biết trước nồng độ ban đầu thành nhiều nồng độ khác nhau. Ở đây chúng tôi sử dụng nồng độ mẫu ban đầu là 2x107 bản sao/ml, sau đó pha loãng bậc 10 liên tiếp thành các nồng độ 2x106
, 2x105, 2x104, 2x103, 2x102, 2x101 bản sao/ml. Ở mỗi nồng độ, chúng tôi tiến hành khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được khảo sát từ các thí nghiệm trên, từ đó xác định nồng độ thấp nhất mà phương pháp vẫn cho kết quả rõ ràng và chính xác.
Sản phẩm PCR sau khi điện di cho kết quả như hình 16.
Hình 16: Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình
Trong đó:
Giếng 1: Thang DNA 100 bp
Giếng 2: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x107 bản sao/ml Giếng 3: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x106 bản sao/ml Giếng 4: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x105 bản sao/ml Giếng 5: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x104 bản sao/ml Giếng 6: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x103 bản sao/ml Giếng 7: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x102 bản sao/ml Giếng 8: Mẫu DNA IHHNV có nồng độ 2x101 bản sao/ml
400 bp
Với kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng: ở nồng độ mẫu là 104 - 107 vẫn có thể nhìn thấy rõ tín hiệu của các vạch, đến nồng độ 103 thì vạch sáng mờ đi nhiều và đến các nồng độ 102 trở về sau thì không còn thấy xuất hiện vạch sáng nữa.
Như vậy, chúng tôi có thể kết luận độ nhạy của phản ứng là 2x103 bản sao/ml. Với phương pháp phát hiện bệnh dựa trên kỹ thuật PCR và điện di để nhận biết thì việc có thể phát hiện mẫu bệnh có mang virus ở nồng độ 2x103 là khá nhạy.
3.3. Ứng dụng quy trình trên mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh
Ứng dụng quy trình trên với 30 mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh thu nhận từ các trại tôm nuôi ở Cam Ranh – Khánh Hòa, chúng tôi thu được kết quả như hình 17. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 17: Kết quả ứng dụng quy trình trên mẫu nghi ngờ nhiễm bệnh IHHNV 1 2 3 4 5 6 T 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 T 22 23 24 25 26 27 28 29 30 300 bp 400 bp 400 bp 300 bp
- Giếng T : Thang DNA 100 bp.
- Giếng 1 – 30: DNA của 30 mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh.
Trong tổng số 30 mẫu tôm khảo sát, có 5 mẫu dương tính với IHHNV, chiếm tỷ lệ 16.67%. Điều đó chứng tỏ khả năng ứng dụng quy trình để phát hiện IHHNV trên tôm. Tuy nhiên, để kết quả này có độ tin cậy cao hơn, cần khảo sát thêm trên nhiều mẫu thu từ các vùng nuôi trọng điểm của cả nước để đánh giá tốt hơn khả năng ứng dụng của quy trình.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Đề tài về cơ bản đã hoàn thành mục tiêu đề ra, đó là:
- Xây dựng thành công quy trình phát hiện bệnh IHHNV trên tôm với độ nhạy là 2x103 bản sao/ml.
- Khảo sát khả năng ứng dụng của quy trình nhằm phát hiện IHHNV trên các mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh thu nhận từ các trại tôm nuôi ở Cam Ranh – Khánh Hòa (30 mẫu). Kết quả bước đầu cho thấy không xuất hiện các vạch ký sinh, chứng tỏ mồi thiết kế được có độ đặc hiệu cao.
Kiến nghị
Từ kết quả thu được ở trên, chúng tôi có một số kiến nghị sau:
- Tiếp tục khảo sát quy trình với số lượng mẫu lớn hơn, thu từ nhiều nguồn khác nhau, từ nhiều địa phương khác nhau (đặc biệt là từ các vùng nuôi tôm trọng điểm của cả nước) để có thể hoàn thiện hơn quy trình này. - Khảo sát độ đặc hiệu của mồi với một số chủng vi khuẩn khác có trong
nước cũng như vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản để chắc chắn mồi chỉ đặc hiệu với IHHNV.
- Khảo sát thêm một số điều kiện (quá trình xử lý - tách chiết DNA từ mẫu, các dung dịch đệm) để làm tăng độ nhạy của quy trình.
- So sánh kết quả với bộ Kit của các công ty khác để khẳng định khả năng ứng dụng của quy trình.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
[1] http://www.agriviet.com
[2] http://www.khoahocthuysan.org [3] http://www.mekongfish.net.vn
[4] Phạm Văn Hùng, Phạm Hùng Vân (2009). Virus gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu. Y học TP. Hồ Chí Minh *Tập 13* Phụ bản của số 2*2009.
[5] Phạm Văn Hùng, Nguyễn Tấn Bình, Nguyễn Đăng Ninh, Phạm Hùng Vân, Phạm Thành Hổ (2009). Sự phổ biến của virus gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan
tạo máu trên tôm sú nuôi tại Việt Nam. Y học TP. Hồ Chí Minh *Tập 13* Phụ bản của số 2*2009.
[6] Phan Đặng Thiên An, Phạm Văn Hùng, Hoàng Hiếu Ngọc, Phạm Hùng Vân (2009). Giải trình tự bộ gen infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV). Y học TP. Hồ Chí Minh *Tập 13* Phụ bản của số 2*2009.
Tài liệu Tiếng Anh
[7] Dhar A, Roux M, Klimpel K (2001).Detection and Quantification of Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus and White Spot Virus in Shrimp Using Real-Time Quantitative PCR and SYBR Green Chemistry. Journal Of Clinical Microbiology: 2835–2845
[8] Yang B, Song X, Huang J, Shi C, Liu L (2007). Evidence of existence of Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) in penaeid shrimp cultured in China.Veterinary Microbiology, 120: 63-70.
[9] Bui Thi Bich Hang (2007). Development of a monoclonal antibody assay for infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) of shrimp. Mahidol University: 13-26.
[10] Lightner D, Redman R, Bell T (1983). Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis, a Newly Recognized Virus Disease of Penaeid Shrimp.
Journal of Invertebrate pathology, 42: 62-70.
[11] Bonami J, Trumper B, Mari J, Brehelin M, Lightner D (1990). Purification and characterization of the infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus of penaeid shrimps. Journal of General Virology, 71: 2657-2664. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});