CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Mô hình nghiên cứu
Hình 2.1: Mô hình nghiên cứu
Phân tích phát hiện Salmonella theo TCVN 4829:2008 (ISO 6579:2002/Amd.1:2007)
Mẫu thịt tươi
Mẫu không phát hiện Salmonella
Mẫu phát hiện Salmonella
Lưu mẫu và tăng sinh
Khảo sát các chủng Salmonella spp.
Tính kháng Kháng sinh Lấy mẫu
Báo cáo đánh giá
Nồng độ ức chế tối thiểu
(MIC)
Tỷ lệ serotype huyết thanh Tỷ lệ nhiễm
Salmonella spp.
2.2.2 Phương pháp nuôi cấy phát hiện Salmonella ppp. trong thịt tươi Quy trình phát hiện gồm 4 bước: tăng sinh không chọn lọc, sau đó tiếp tục bước tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định theo sơ đồ như sau:
Hình 2.2: Quy trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm [2]
2.2.3 Phương pháp khoanh giấy Kháng sinh khuếch tán trong thạch (Kirby-Bauer)
+ Chuẩn bị nồng độ vi khuẩn thử nghiệm đạt độ đục chuẩn Mc Farland 0,5 và trải vi khuẩn lên mặt thạch Mueller - Hinton. Đặt đĩa Kháng sinh lên mặt thạch đã trải vi khuẩn. Các đĩa này được để trong nhiệt độ phòng khoảng 30 phút cho Kháng sinh khuếch tán. Ủ ấm các đĩa ở 37oC trong 18 - 20 giờ. Sau đó đọc kết quả và ghi nhận:
+ Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước đo từ phía sau mặt đĩa. Đường kính vô khuẩn là một vòng kể cả đường kính Kháng sinh và hoàn toàn không có vi khuẩn mọc được nhìn thấy bằng mắt thường.
+ Đường kính vòng vô khuẩn dựa bảng chuẩn theo NCCLS để suy ra kết quả: vi khuẩn nhạy cảm, trung gian hay kháng đối với Kháng sinh thử nghiệm [24].
2.2.4 Phương pháp pha loãng Kháng sinh xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn – MIC (Minimum Inhibitory Concentration)
Chuẩn bị Kháng sinh: Chuẩn bị dung dịch Kháng sinh pha từ Kháng sinh tinh khiết để có nồng độ 10mg/mL, sau đó pha thành 5,12mg/mL bằng cách lấy 512àl Khỏng sinh và thờm vào 488àl mụi trường CAMHB. Phõn thành cỏc thể tớch nhỏ, mỗi thể tớch 100àl rồi giữ ở -70oC, mỗi thể tớch nhỏ này chứa hàm lượng Khỏng sinh là 512àg đủ để pha một dóy nồng độ Khỏng sinh trong mụi trường làm Kháng sinh đồ.
Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm: Vi khuẩn thử nghiệm được chuẩn bị để đạt 106CFU/mL tức là 1/100 của độ đục chuẩn McF 0,5. Chuẩn bị bằng cách cấy vi khuẩn thử nghiệm vào trong môi trường CAMHB cho đến khi đạt hay điều chỉnh đạt McF 0,5. Hay cách khác là làm huyền dịch vi khuẩn từ 4 - 5 khúm vi khuẩn (mọc trên mặt thạch máu đã cấy ủ qua đêm) vào môi trường CAMHB để đạt McF 0,5. Phương pháp chuẩn bị từ khúm vi khuẩn là bắt buộc phải áp dụng cho Kháng
sinh đồ tụ cầu đối với các Kháng sinh oxacillin, methicillin hay nafcillin, nhưng cũng có thể áp dụng cho các vi khuẩn khác. Pha loãng ngay (không được chậm quá 15 phút) huyền dịch vi khuẩn đã chuẩn bị này thành 1/100 trong CAMHB để đạt 106CFU/mL bằng cỏch pha 60àl huyền dịch vi khuẩn đó chuẩn bị (0,5 McF) vào một ống mụi trường chứa sẵn 5940àl CAMHB vụ trựng. Huyền dịch vi khuẩn 106CFU/mL phải được đưa vào làm thí nghiệm ngay trong vòng không quá 15 phút.
Ngoài vi khuẩn thử nghiệm, để kiểm soát chất lượng của thí nghiệm bao gồm chất lượng Kháng sinh, chất lượng của phương pháp thực hiện, hàng tuần hay hàng tháng nên chuẩn bị thêm các vi khuẩn chuẩn S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, và P. aeruginosa ATCC 27853 như cách chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm để được làm thử nghiệm cùng với vi khuẩn thử nghiệm.
Tiến hành thử nghiệm: Chuẩn bị một dãy 12 ống nghiệm vô trùng cho vào giá đựng, dùng bút acetone đánh số thứ tự từ 1 đến 12. Cho vào mỗi ống nghiệm từ số 2 đến số 12, mỗi ống 0,5mL canh thang CAMBH vô trùng, riêng ống số 1 cho vào 0,95mL CAMHB. Cho 50àl dung dịch Khỏng sinh cú hàm lượng 512àg/100àl đã chuẩn bị ở trên vào ống nghiệm số 1. Như vậy ống nghiệm này có nồng độ Khỏng sinh là 256àg/mL. Tiến hành pha loóng Khỏng sinh theo hệ số 1/2 bằng cỏch hút 0,5mL từ ống 1 sang ống 2, trộn đều bằng lắc rung vài giây sau đó dùng pipette mới hút 0,5mL từ ống 2 sang ống 3, trộn đều bằng lắc rung vài giây rồi dùng pipette mới hút 0,5mL từ 3 sang 4, và cứ tiếp tục như vậy cho đến ống 11. Sau khi pha loãng dãy Kháng sinh, dùng pipette cho huyền dịch vi khuẩn 106CFU/mL đã chuẩn bị ở trên vào các tube 1 đến 10 và 12, trừ tube 11, mỗi tube 0,5mL huyền dịch vi khuẩn. Ủ dãy tube đã thực hiện thử nghiệm này ở 35 – 37oC trong 16 – 24 giờ. Cần phải ủ cho đủ 24 giờ đối với Kháng sinh đồ phát hiện enterococci kháng vancomycin hay tụ cầu kháng methicillin. Không có yêu cầu ủ trong tủ CO2.
Đọc kết quả: Trước hết đọc kết quả trên ống 12 là ống không có Kháng sinh để kiểm tra vi khuẩn thử nghiệm có mọc không. Vi khuẩn mọc là làm đục môi trường hay tạo cặn ≥ 2mm đường kính hay nhiều cụm cặn ở đáy ống. Ống 12 bắt buộc phải có vi khuẩn mọc. Nếu ống 12 không có vi khuẩn mọc thì phải làm lại thử nghiệm. Tiếp đó đọc kết quả ống 11 là ống không có vi khuẩn để kiểm tra phương
pháp pha loãng Kháng sinh có bị tạp nhiễm không. Nếu ống 11 có vi khuẩn mọc thì có nguy cơ tạp nhiễm và cũng phải làm lại thử nghiệm. Sau khi đã đọc kết quả hai ống 12 và 11 cho biết chất lượng thử nghiệm tốt, tiến hành đọc kết quả MIC, được xác định là ống cuối cùng có nồng độ Kháng sinh thấp nhất ngăn chặn, không cho vi khuẩn mọc với tiêu chuẩn vi khuẩn mọc là so với ống 12. Đối với Kháng sinh co- trimoxazole thì chấp nhận MIC ở giếng cuối cùng có giảm 80% vi khuẩn mọc so với giếng 12. Nếu trong dãy tube có vi khuẩn mọc, có một tube không có vi khuẩn mọc thì có thể bỏ qua tube này. Tuy nhiên nếu có nhiều hơn một tube vi khuẩn không mọc hay các tube có nồng độ Kháng sinh thấp thì không có vi khuẩn mọc trong khi tube có nồng độ Kháng sinh cao lại có vi khuẩn mọc thì không đọc kết quả mà phải làm lại thí nghiệm.
+ Đọc từ nồng độ thấp nhất. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ Kháng sinh nhỏ nhất có tác dụng ức chế sự phát triển có thể thấy được của vi khuẩn trên môi trường thạch.
+ Ở nồng độ thấp nhất, không thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó. Ở nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận lớn hơn nồng độ đó [24].
Hình 2.3: Phương pháp thực hiện MIC bằng phương pháp pha loãng Kháng sinh trong tube [24]
2.2.5 Xử lý số liệu: Số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kế với phần mềm Excel 2010