KHU VỰC NGHIÊN CỨU
3.2 Phương pháp nghiên cứu
Thu thập số liệu ở rừng ngập mặn Cần Giờ, sau đó xử lí bằng những phần mềm chuyên dụng.
3.2.1 Thu thập tài liệu
Thu thập các tài liệu có liên quan quan đến rừng ngập mặn, Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ và các tài liệu về các cây thuộc họ Đước: Sách, báo, tạp chí, các trang web, các bản đồ...
3.2.2 Ngoại nghiệp
3.2.2.1 Thu mẫu, bảo quản và làm tiêu bản cố định
* Thu mẫu
- Thu thập số liệu tại Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
- Xác định các loài cây, số cây cần để thu mẫu lá trên thực địa.
+ Chọn những cây sinh trưởng phát triển bình thường, không sâu bệnh để lấy mẫu.
+ Dùng kéo để cắt mẫu lá.
+ Thu mẫu để so sánh các chỉ tiêu: Ở mỗi loài thu 32 lá có kích thước khác nhau, những lá này được lấy ở các vị trí 1/3, 2/3 chiều dài tán cây và những tán cây này nằm ở vị trí 1/3, 2/3 trên thân cây. Tổng số lá phải thu: 32 lá/loài x 6 loài = 192 lá.
- Sau khi thu mẫu phải giữ cho các lá được thẳng bằng cách ép trong khung gỗ.
Khi thấy lá hơi héo thì cho vào máy để scan ngay. Mỗi lá lưu lại dưới dạng ảnh số và có ký hiệu riêng.
- Số liệu thu được sử dụng để mô tả và xây dựng các phương trình tương quan giữa các chỉ tiêu của lá.
* Bảo quản
Các mẫu lá ngay sau khi cắt rời khỏi cây phải được ngâm cố định trong dung dịch focmon 5%. Những mẫu lá này phải được đặt chìm hẳn vào trong dung dịch và xung quanh nó không có các lớp bọt khí bao bọc. Nhằm mục đích: Ngăn chặn quá trình tự phá hoại do men hay sự thối rữa trong các mô, làm cho các mô cứng hơn qua đó dễ cắt và dễ nhuộm hơn.
* Làm tiêu bản giải phẫu cố định
Muốn giữ lâu dài tiêu bản giải phẫu thực vật thì phải cố định vi phẫu trong một môi trường đặc biệt. Người ta thường dùng bôm Canada đã pha loãng trong xylen (C6H4(CH3)2) để làm môi trường cố định. Các bước tiến hành như sau:
- Cắt mẫu
Mẫu thực vật được cắt bằng tay theo kiểu cắt ngang là kiểu phổ biến nhất, lát cắt nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục của vật cắt. Chúng tôi tiến hành cắt như sau: Cắt một khoanh khoai lang đặt làm thớt cắt, cầm vật cắt ở tay trái, kẹp giữa 2 ngón cái và ngón giữa, ngón trỏ được dùng như điểm tựa cho lưỡi dao. Tay phải
- Nhuộm mẫu
+ Những mẫu vi phẫu sau khi cắt được nhuộm màu bằng phương pháp nhuộm kép với trình tự các bước như sau:
B1. Vi phẫu sau khi cắt ngâm ngay trong nước Javen 15 – 30 phút để loại hết nội dung của tế bào.
B2. Rửa sạch mẫu bằng nước thường để loại Javen.
B3. Ngâm mẫu trong axic axetic trong 2 phút để loại hết vết nước Javen còn dính lại.
B4. Rửa mẫu bằng nước thường để loại axic axetic.
B5. Nhuộm đỏ mẫu trong dung dịch cacmin – phèn chua trong 30 phút.
B6. Rửa sạch mẫu bằng nước thường rồi nhuộm xanh bằng dung dịch xanh metylen trong 1 phút.
B7. Rửa sạch bằng nước thường sau đó quan sát trong một giọt glixerin.
Màng tế bào bằng xenluloza sẽ bắt màu đỏ, màng tế bào hóa gỗ, hóa suberin bắt màu xanh.
+ Kết quả nhuộm màu sẽ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tính chất hoá lý của vật nhuộm, chất lượng của thuốc nhuộm, nồng độ và độ pH của dung dịch nhuộm, nhiệt độ và thời gian nhuộm, phương pháp tẩy và rửa sau khi nhuộm v.v…
- Loại nước: Vi phẫu cần phải loại hết nước trước khi đưa vào môi trường cố định. Những vi phẫu được cắt từ lá thực vật thường mềm và mỏng, do đó để hạn chế hiện tượng bị co rúm trong khi loại nước phải loại nước từ từ trong những độ cồn cao dần: 150, 300, 450, 600, 750, 900, 990. Cách làm như sau:
+ Ở những nồng độ thấp: Cồn 150, cồn 300, cồn 450.Ngâm vi phẫu trong khoảng từ 5 đến 10 phút, ở mỗi nồng độ cồn sẽ rửa từ 2 – 3 lần.
+ Những vi phẫu được rửa nhanh từ 2 – 3 lần, mỗi lần 1 – 2 phút trong cồn có nồng độ cao: 600, 750, 900.
+ Chuyển vào cồn tuyệt đối 990, rửa 2 – 3 lần, mỗi lần ngâm 10 phút.
+ Cuối cùng, chuyển vào xylen nguyên chất, rửa 2 lần, mổi lần để 10 phút.
Và ngâm vi phẫu cố định trong xylen.
- Lên kính
+ Nhỏ lên phiến kính 1 giọt bôm Canada (đã được pha loãng trong xylen).
+ Đặt vi phẫu đã loại hết nước vào giữa giọt bôm Canada sao cho vi phẫu nằm chìm dưới bôm, rồi đậy lá kính lên.
+ Để tiêu bản nằm ngang ở nơi thoáng gió, ít nhất trong một tuần, để cho xylen bay hơi, đến khi bôm khô cứng lại là được [8].
3.2.2.2 Phương pháp đo kích thước tế bào ở kính hiển vi
- Để đo kích thước của những vật nhỏ đang quan sát ở kính hiển vi thì người ta so sánh kích thước của vật cần đo với một thước đo thị kính được lắp thêm vào kính hiển vi. Từ giá trị của mỗi khoảng cách tên thước đo này (ở mỗi độ phóng to khác nhau, đã được tính trước nhờ một thước đo vật kính) sẽ suy ra kích thước của vật đo.
Hình 3.1: Thước đo tế bào lá trên kính hiển vi
- Đặt thước đo vật kính lên mâm kính, điều chỉnh kính hiển vi để nhìn rõ các vạch chia tên đó. Lắp thước đo thị kính vào kính hiển vi. Nhìn vào thị kính và điều chỉnh cho 2 thước đó nằm song song và hơi chập vào nhau. Tiếp tục điều chỉnh để cho 1 vạch ở thước đo thị kính trùng với 1 vạch trên thước đo vật kính. Tìm một vạch thứ 2 nào đấy cũng trùng nhau như vậy. Ví dụ ở kính hiển vi có độ phóng to 32 (thị kính 10x, vật kính 3,2x) thì 5 khoảng cách của thước đo thị kính (a) trùng hoàn toàn với 22 khoảng cách của thước đo vật kính (b). Người ta đã biết mỗi thước
đo vật kớnh dài 10 àm. Vậy chiều dài của một khoảng cỏch trờn thước đo thị kớnh ở độ phóng đại nói trên là:
(b x 10) / a = (22 x 10) / 5 = 44 àm
- Sau đó, bỏ thước đo vật kính ra và thay vào đó tiêu bản có mang vật cần đo kích thước.
- Điều chỉnh mâm kính, thị kính (nếu trong đó có đặt thước đo thị kính, để cho thước đo nằm đúng chiều cần đo trên mẫu vật). Đọc số vạch trên thước đo thị kính tương ứng với vật đo. Kớch thước đo được (tớnh bằng àm) sẽ bằng số vạch núi trờn nhân với chiều dài của một vạch [8].
3.2.3 Nội nghiệp
- Xử lý ảnh bằng phần mềm ACDSee Photo Manager 12.
- Sử dụng phần mềm Excel 2003 và Statgraphic Plus 3.0 để xử lý các số liệu thu thập.
- Sử dụng phần mềm ImageJ để tính diện tích lá S (cm2), chiều dài lá L (cm) và chiều rộng lá W (cm) được đo ở vị trí trung bình chiều dài của lá.
Hình 3.2: Hình biểu thị các chỉ tiêu của lá Vẹt trụ
- Sử dụng ANOVA để so sánh chiều dài lá L (cm), chiều rộng lá W (cm), tỷ lệ L/W của lá giữa các loài với nhau.