L ời cảm ơn
3.6. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N 1–
Hình 3.8. Cây gia hệphân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1- nhóm 2, 2001-2009
3.6.2. Sự tương đồng về gen giữa các chủng cúm A/H1N1pdm09 giảm độ nhạy cảm oseltmivir với các chủng cúm A/H1N1pdm09 trên thế giới
Tổng số 119 trình tự toàn bộ độ dài phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút A/H1N1pdm09 bao gồm các vi rút đại diện lưu hành tại Việt Nam (65 trình tự) và các nước trong khu vực được đưa vào phần mềm Mega 5 xây dựng cây gia hệ vi rút A/H1N1pdm09 sử dụng phương pháp Maximum Likelihood. Chủng dự tuyển văc xin A/California/07/99 được chọn làm gốc của cây gia hệ. Hình 3.9 cho thấy, các chủng cúm H1N1pdm09 năm 2009 và 2010 tại Việt Nam có độ tương đồng cao với các chủng lưu hành tại Thái Lan và Trung Quốc, không thể hiện sự phân nhánh rõ ràng so với chủng gốc A/California/07/99. Bốn phân đoạn gen mã hóa HA của các vi rút A/H1N1pdm09 giảm độ nhạy cảm oseltamivir năm 2009 tương đồng cao với các chủng lưu hành trong cùng năm. Đối với các vi rút gây dịch năm 2011 và 2013, chúng tôi nhận thấy đã có sự phân tách nhánh thành hai nhánh riêng biệt cho từng năm (2011 và 2013). Vi rút giảm độ nhạy cảm với oseltamivir năm 2011 nằm trong phân nhánh cùng với các vi rút khác lưu hành cùng năm (Hình 3.9).
Phân đoạn gen mã hóa NA của các chủng H1N1pdm09 thể hiện sự tương đồng cao với chủng dự tuyển văc xin A /California/07/99 và các chủng khác lưu hành tại các nước láng giềng Thái Lan, Trung Quốc và các nước trong khu vực Singapore, Đài Loan-Trung Quốc, Úc từnăm 2009-2011. Phân đoạn gen mã hóa NA của các vi rút giảm độ nhạy oseltamivir không có biểu hiện tách nhánh, thể hiện sựtương đồng cao với các chủng cùng thời kỳ.
Như vậy, tuy có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir với các mức độ khác nhau, mang đột biến trên protein NA tại vị trí H275Y nhưng năm chủng H1N1pdm09 không thể hiện sự khác biệt trong quá trình tiến hóa của vi rút (Hình 3.10).
Hình 3.9. Cây gia hệphân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1pdm09, 2009-2012
Hình 3.10. Cây gia hệphân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1pdm09, 2009-2012
3.6.3. Sự tương đồng về gen giữa các chủng cúm A/H5N1 giảm độ nhạy cảm oseltmivir với các chủng cúm A/H5N1 trên thế giới
Sử dụng phần mềm MEGA5, phương pháp Maximum Likelihood để xây dựng cây gia hệ HA và NA của vi rút cúm A/H5N1. Trình tự toàn bộ độ dài phân đoạn gen mã hóa HA (1778 nucleotide) của các chủng cúm gia cầm A/H5N1 gây bệnh trên người (25/28 chủng) và động vật tại Việt Nam cùng các chủng H5N1 trên người và gia cầm tại các nước và vùng lãnh thổ khác như Hồng Kông, Thái Lan, Indonesia, Trung Quốc thu thập theo chiều dài thời gian nghiên cứu được đưa vào cây gia hệ. Gốc của cây gia hệ được xác định là vi rút A/Hongkong/156/97, chủng vi rút H5N1 đầu tiên phân lập được trên người [107], cùng với các vi rút trên gia cầm tại Quảng Đông (1996), Sơn Đông (2003) và vi rút gây bệnh trên người tại Hồng Kông năm 1997 tạo thành clade 0 [95]. Hình 3.11 cho thấy từ clade 0, vi rút H5N1 phát triển thành nhiều clade khác nhau, tính đến 2012, có tổng số 10 clade được đề cập đến (0-9). Vi rút H5N1 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam (6 chủng) từ năm 2003-2005 tập trung tại calde 1, có sự tương đồng với các chủng H5N1 của Thái Lan, Trung Quốc và Cambodia. Chủng H5N1 giảm độ nhạy cảm với oseltamivir A/Vietnam/HN30408/2005 nằm trong phân nhánh của các vi rút lưu hành năm 2004 và 2005. Các vi rút thu thập được trong những năm tiếp theo thể hiện sự phân tách rõ rệt sang clade 2, vi rút H5N1 tại Việt Nam nằm trong phân nhánh 2.3.4 cùng các chủng vi rút đến từ Trung Quốc với sự xuất hiện sớm nhất của chủng A/Vietnam/HN30850/2005. Tuy nhiên, trong phân nhánh này, các vi rút lại phân tách thành những phân nhánh nhỏ hơn từ 2.3.4.1 đến 2.3.4.3. Clade 2.3.4.3 bao gồm hầu hết các vi rút H5N1 gây bệnh trên người và động vật tại Việt Nam năm 2007 và 2008, tương đồng với chủng A/chicken/Fujian/1/2007 của Trung Quốc. Hai chủng A/Vietnam/HN31412/2008 và A/Vietnam/HN31413/2008 mang đột biến liên quan đến kháng thuốc tại vị trí I117V trên protein NA và có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir cũng nằm trong phân nhánh 2.3.4.3.
Như vậy, với các vi rút H5N1 trên người nhạy cảm hoặc giảm sự nhạy cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam, phân đoạn gen mã hóa HA đều có sự tiến hóa chung với các chủng lưu hành trên gia cầm tại Việt Nam và có sự tương đồng với các chủng H5N1 gây bệnh tại miền Nam Trung Quốc (Hình 3.11-3.13).
Kết quả phân tích cây gia hệphân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm A/H5N1 cho thấy, phân đoạn gen mã hóa NA được phân tách thành hai nhóm chính. Nhóm thứ nhất là các vi rút H5N1 lưu hành trên chim hoang có phân đoạn gen mã hóa NA đầy đủ. Nhóm thứ hai bao gồm các vi rút H5N1 mang protein NA bị mất 20 axit amin ở phần thân được ghi nhận thích ứng vào gia cầm và gây bệnh cho người [95]. Nhóm thứ hai hình thành bởi các các vi rút mang phân đoạn gen mã hóa HA thuộc clade 1, clade 2.3.4.3 và 2.3.4.2. Không có sự phân tách thành nhiều nhóm phụnhư cây HA, tuy nhiên các vi rút thuộc nhóm II cũng hình thành 2 nhóm phụ chính (2A và 2B tương đương clade 1 và clade 2 theo phân đoạn gen mã hóa HA). Vi rút A/Vietnam/HN30408/2005 mang đột biến H275Y biểu hiện giảm độ nhạy với oseltamivir thuộc nhóm 2A. Hai vi rút còn lại đã được xác định mang đột biến I117V trên protein NA (A/Vietnam/HN31412/2008 và A/Vietnam/HN31413/2008) nằm trong nhóm 2B. Kết quả trên cho thấy, phân đoạn gen mã hóa NA của các vi rút mang đột biến liên quan đến giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir không nằm ngoài nhóm các vi rút lưu hành cùng thời kỳ và có sự tiến hóa tương đương với phân đoạn gen mã hóa HA (Hình 3.14).
Như vậy, các vi rút H5N1 trong nghiên cứu có biểu hiện giảm độ nhạy với oseltamivir mang phân đoạn gen mã hóa HA và NA có cùng độ tiến hóa với các vi rút H5N1 trên người và các vi rút gây bệnh trên gia cầm khác tại miền Bắc Việt Nam.
A/H5N1, 2003-2010
Hình 3.12. Cây gia hệphân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H5N1 clade 1, 2003-2004
A/H5N1 clade 2.3.4, 2007-2010
A/H5N1, 2003-2010
CHƯƠNG IV - BÀN LUẬN
4.1. Sựlưu hành của các vi rút cúm A trong khoảng thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu của chúng tôi dựa trên các chương trình giám sát cúm đã thực hiện tại miền Bắc Việt nam từ năm 2001-2005 và chương trình giám sát cúm quốc gia từ 2006-2012. Kết quả giám sát cho thấy vi rút cúm mùa là A/H1N1 và A/H3N2 lưu hành luân phiên nhau trong khoảng thời gian 2001 đến đầu năm 2009 [1, 5]. Từ tháng 5 năm 2009, vi rút A/H1N1pdm09 xuất hiện gây đại dịch toàn cầu và tiếp tục gây dịch trong các năm tiếp theo cùng vi rút cúm A/H3N2 đã biết [38, 77, 98, 108].
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 Th án g 1 Th án g 3 Th án g 5 Th án g 7 Th án g 9 Th án g 11 Th án g 1 Th án g 3 Th án g 5 Th án g 7 Th án g 9 Th án g 11 Th án g 1 Th án g 3 Th án g 5 Th án g 7 Th án g 9 Th án g 11 Th án g 1 Th án g 3 Th án g 5 Th án g 7 Th án g 9 Th án g 11 Th án g 1 Th án g 3 Th án g 7 Th án g 9 Th án g 11 Th án g 1 Th án g 3 Th án g 5 Th án g 7 Th án g 9 Th án g 11 Th án g 1 Th án g 3 Th án g 5 Th án g 7 Th án g 9 Th án g 11 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 H1N1pdm09 H1N1 H3N2 Cúm B
Biểu đồ 4.1. Sựlưu hành vi rút cúm tại Việt Nam 2006 - 2012
Số lượng 342 chủng cúm A thu được trong nghiên cứu trong giai đoạn 2001- 2012 với các phân típ đại diện cho từng năm lưu hành đã đảm bảo tính bao quát của nghiên cứu. Với số lượng 42 vi rút cúm A/H1N1; 157 vi rút cúm A/H1N1pdm09; 115 vi rút cúm A/H3N2 và 28 vi rút cúm A/H5N1 phản ánh quy mô của hoạt động giám sát cúm tại Việt Nam. Trong giai đoạn 2001-2005, giám sát cúm chưa thành hệ thống, chỉđược thực hiện tại một số điểm giám sát của Hà Nội vì vậy sốlượng vi rút thu thập trong các năm này thấp dao động từ 4 vi rút (2001) đến 19 vi rút (2003), trong khi số vi rút thu thập tại các năm sau đó cao hơn từ 24 vi rút (2007) đến 132 vi rút (2009) sau khi hệ thống giám sát cúm quốc gia hình thành với sựtăng số điểm giám sát thường xuyên (Bảng 3.1). Tỷ lệ của các phân típ vi rút thu thập trong từng năm của nghiên cứu tương đồng tỷ lệlưu hành các phân típ vi rút cúm A trong kết quả giám sát (Bảng 3.1, Biểu đồ 5.1). Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng vi rút phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng dương tính với RT-PCR, vì vậy một số phân típ vi rút sẽ không có mặt trong nghiên cứu khi sự lưu hành của phân típ này với tỷ lệ quá thấp, ví dụ năm 2012 có ghi nhận sự lưu hành của A/H1N1pdm09 (Biểu đồ 5.1), nhưng không phân lập được vi rút (Bảng 3.1). Vì vậy kết quả nghiên cứu tuy mang tính tổng quan nhưng chưa thực sự đại diện và đầy đủ, do đó việc nâng cao hiệu quả của công tác phân lập vi rút là rất cần thiết trong những nghiên cứu tiếp theo.
Song hành với các vi rút cúm mùa, vi rút cúm gia cầm A/H5N1 được xác định gây bệnh trên người từ năm 1997 và bùng phát năm 2003 với tỉ lệ tử vong cao. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, tại Việt Nam tính đến năm 2013 có 125 ca mắc và 62 ca tử vong (49,6%) [115]. Khác với các vi rút cúm mùa, sự xuất hiện vi rút A/H5N1 tại Việt Nam không theo chu kỳvà được xác định có liên quan đến sự nhiễm cúm trên đàn gia cầm [55, 75, 123]. Tổng số 28 chủng vi rút cúm A/H5N1 thu thập trong nghiên cứu được tập trung vào các năm 2004, 2007 và 2008; không thu thập được trong các năm 2006, 2011 và 2012 (Bảng 3.1). Trong năm 2006, không ghi nhận trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 tại Việt Nam, tiếp theo các năm 2011 và 2012 số người nhiễm vi rút cúm A/H5N1 có được ghi nhận tại Việt Nam,
tuy nhiên các trường hợp này chỉ được xác định tại khu vực phía Nam [115]. Như vậy, kết quả thu thập vi rút cúm gia cầm A/H5N1 trong nghiên cứu này đã phản ánh đúng tình hình nhiễm cúm A/H5N1 trên người tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2003-2012.
4.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trịức chế 50% (IC50)
4.2.1 Giá trị IC50 ngưỡng của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam
Phương pháp xác định giá trị ức chế 50% (IC50) của oseltamivir bằng thử nghiệm ức chế neuraminidase (chất phát quang flouroresence) với các vi rút cúm A lần đầu tiên được áp dụng tại PTN cúm viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương với mục đích xác định giá trịngưỡng (IC50) của từng típ/phân típ vi rút cúm để từđó có thể xác định mức độ giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại Việt nam theo thường quy của TCYTTG.
Từ những kết quả thu được trong nghiên cứu cho thấy sự tương tác của oseltamivir tới mỗi phân típ vi rút cúm khác nhau không giống nhau cho dù có cùng kiểu dạng protein NA thể hiện ở giá trị IC50 trung bình cho các phân típ vi rút cúm mang protein NA1 lưu hành tại Việt Nam (Bảng 3.2). Kết quả của chúng tôi phù hợp với những nghiên cứu trước đó tại Úc, Anh và Nhật [36, 79, 104, 122]. Tại Anh, giá trị IC50 trung bình của vi rút cúm A/H1N1 và A/H3N2 lần lượt là 0,45- 1,73 nM và 0,2-0,94 nM [122]. Sự khác nhau này có thể giải thích do mỗi vi rút cúm xâm nhập vào các quần thể người khác nhau có thể tạo ra các biểu hiện kiểu hình (phenotype) khác nhau trong quá trình tiến hóa. Ngoài ra, sự khác nhau về giá trị ngưỡng của típ/phân típ vi rút cúm có thể do mỗi neuraminidase của từng loại cúm có sựtương tác khác nhau với oseltamivir, điển hình là vi rút cúm B, trên phân đoạn gen mã hóa NA không mang các đột biến liên quan đến kháng thuốc nhưng giá trị IC50thu được cao hơn ở vi rút cúm A [79] hoặc vi rút cúm A/H5N1 có giá trị
IC50 trung bình cao hơn các phân típ cúm A khác như đã trình bày trong phần Kết quả.
Theo dõi được sự đa dạng trong tương tác của vi rút cúm với oseltamivir theo từng năm ta có thể xây dựng được cơ sở dữ liệu về giá trị IC50 của từng vi rút cúm theo từng phân típ, tạo nền tảng để thực hiện công tác giám sát kháng thuốc của vi rút cúm tại miền Bắc Việt Nam nói riêng và mở rộng ra toàn quốc nói chung. Theo hướng dẫn của tổ chức APHL (Association of Public Health Laboratories), giá trị IC50 trung bình của mỗi phân típ cúm phải được cập nhật theo từng năm. Mỗi năm ít nhất 20 chủng vi rút thuộc từng phân típ cúm phải được thực hiện xác định giá trị IC50và đưa vào cơ sở dữ liệu [8].
Sựtương tự về kết quả trong nghiên cứu được khẳng định, tuy nhiên giá trị thực tế của IC50 tại mỗi quốc gia sẽ khác nhau, ví dụ vi rút cúm B tại Việt Nam có IC50 được xác định là 24,79 nM, trong khi giá trị này tại Anh được xác định là 15.19 nM [122]. Vì vậy, việc xác định giá trịngưỡng IC50 cho từng quốc gia, từng khu vực địa lý là cần thiết trong việc tiến hành giám sát sự kháng thuốc tại từng quốc gia. Nghiên cứu của chúng tôi xác định giá trị IC50ngưỡng cho từng phân típ vi rút cúm A được thực hiện dựa trên thực tế của chính các vi rút sử dụng trong nghiên cứu. Sử dụng phần mềm Graphpad prism cho phép xác định được độ tập trung của các cá thểkhác nhau, đồng thời cho phép xác định giá trị giá trị nhỏ nhất, giá trị lớn nhất và khoảng liên tứ phân vị của các giá trị IC50. Từ đó có thể xác định được giá trị ngưỡng thông qua tính đại diện của sốđông trong quần thể nghiên cứu và đảm bảo được sựtương đồng với của từng phân típ khi kết hợp với giá trị IC50 trung bình của vi rút tham chiếu chuẩn được cung cấp bởi hiệp hội quốc tế giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm (ISRIV-AVG) [45]. Giá trị ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A được xác định trong nghiên cứu này đã đảm bảo tính chính xác cho các kết quả của nghiên cứu.
Trong thời gian nghiên cứu, từ2001 đến 2012, vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam luôn thể hiện những sự biến đổi thích nghi với vật chủ (người) tương tự như các phân típ vi rút cúm lưu hành trên thế giới như thay đổi đặc tính kháng