L ời cảm ơn
1.4.Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cú mA
1.4.1. Nguyên nhân và cơ chế của hiện tượng kháng thuốc
Thuốc amatadine: Amantadine được đưa vào sử dụng từ những năm 1960 với mục đích phòng và điều trị cúm A. Theo khảo sát từnăm 1994, hiện tượng kháng amantadine đã xuất hiện [50]. Tìm hiểu nguồn gốc của sự kháng thuốc, phân đoạn gen mã hóa M đã được phân tích trình tựnucleotide đểxác định sự thay đổi có liên quan đến kháng thuốc. Theo các nghiên cứu, hiện tượng kháng amantadine thường xảy ra với các chủng cúm A/H3N2 có xuất hiện các điểm đột biến trên phân đoạn gen mã hóa M (phần M2) dẫn đến thay đổi các axit amin tại các vị trí gắn kết. Năm vịtrí axit amin liên quan đến việc kháng amatadine là 26, 27, 30, 31 và 34, trong đó, vị trí 31, thay đổi từ Serin (Ser-S) sang Arginine (Asn-N), là vị trí thường gặp [9, 42, 89]. Các đột biến này làm vị trí tiếp xúc với thuốc được "nới rộng", không còn tương ứng với kích thước của thuốc, amantadine không gắn được vào đúng vị trí trên protein M2 [82]. Do đó, vi rút không bị ức chế, vẫn tiếp tục quá trình hòa màng, "cởi áo", đưa các RNP và tế bào cảm nhiễm của vật chủ. Ngoài ra, sự kháng thuốc có thể xảy ra không liên quan đến hiện tượng đột biến mà do sựtrao đổi và tích hợp bộ gen (trường hợp vi rút H1N1pdm09 khi xuất hiện kháng 100% với amantadine).
Thuốc oseltamivir: Nguồn gốc của hiện tượng kháng oseltamivir là do có sự thay đổi axit amin tại vùng tiếp xúc của neuraminidase với thuốc, cụ thể là các vị trí I117V, H275Y, N294S trên N1 và E119V, R152K, R292K, N294S trên phân đoạn gen mã hóa N2 [24, 101, 104]. Sự đột biến tại các vị trí này gây giảm hiệu quả tương tác giữa thuốc và neuraminidase dẫn đến sự giảm độ nhạy hoặc kháng của vi
rút với thuốc. Tuy nhiên, theo dõi sự kháng thuốc của vi rút với zanamivir, dường như zanamivir vẫn có hiệu quả trên các chủng vi rút đã kháng với oseltamivir và đây có thể do sự khác nhau về cấu trúc không gian của hai loại thuốc này [79]. Tương tựnhư trường hợp vi rút H1N1pdm09 kháng amantadine, phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm mới xuất hiện trên người A/H7N9 cũng đã mang đột biến tại vị trí R292K liên quan đến kháng oseltamivir thông qua quá trình trao đổi và tích hợp đoạn gen [62].
Như vậy, sự kháng thuốc của vi rút cúm A qua thời gian tập trung vào các nguyên nhân sau: đột biến tại các vị trí liên quan đến sự bám gắn của thuốc trên phân đoạn gen mã hóa NA và M; áp lực duy trì nòi giống của vi rút mà biểu hiện chính là sự trao đổi và tích hợp bộ gen, do đó vi rút hoàn toàn có khả năng mang gen kháng thuốc từ khi mới xuất hiện; sự thích nghi với nhiều loại vật chủ của vi rút cúm A tạo điều kiện thuận lợi cho sự kháng thuốc xuất hiện (vi rút cúm B có tỉ lệ kháng thuốc thấp hợp vi rút cúm A).
1.4.2. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm
Kỹ thuật giải trình tự gen thông thường (phương pháp Sanger)
Việc xác định chủng vi rút có mang gen kháng thuốc sử dụng phương pháp giải trình tự gen thông thường đã được thực hiện từ những năm 90, qua đó có thể theo dõi được sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi rút cúm [93]. Điển hình là sự xuất hiện của hiện tượng kháng amantadine của vi rút A/H3N2, hiện tượng kháng oseltamivir của vi rút A/H1N1 và là phương pháp chủ yếu được lựa chọn để xác định chủng vi rút cúm A kháng amantadine.
*Ưu điểm
Ưu điểm của kỹ thuật là khả năng ứng dụng rộng rãi, có thể giải trình tự nucleotide cho toàn bộ gen đích hoặc từng phần gen có mang vị trí đột biến liên
quan đến kháng thuốc. Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen này cũng có thểxác định được hiện tượng kháng thuốc không hoàn toàn, hoặc nhiều đột biến liên quan đến kháng thuốc. Chủng vi rút mang nhiều đột biến tại các vị trí khác nhau trên gen đích cùng có tác dụng gây kháng thuốc có thể phát hiện được nhờ khả năng giải trình tựđoạn nucleotide dài. Ngoài ra, các đột biến khác không liên quan đến kháng thuốc nhưng có liên quan đến sự tiến hóa, thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút cũng được xác định [93].
*Nhược điểm
Kỹ thuật phải thực hiện trên các gen đích khuếch đại từ các chủng vi rút cúm phân lập, thời gian thực hiện dài và chi phí để thực hiện còn cao.
Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn giới hạn (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism)
Đa hình độdài đoạn giới hạn là kỹ thuật thường được sử dụng phối hợp cùng kỹ thuật PCR [33]. Sử dụng enzyme giới hạn phân tích đoạn gen của vi rút cúm có thể xác định được chủng vi rút có mang đột biến liên quan đến kháng thuốc sau khi thu được sản phẩm PCR. Để thực hiện kỹ thuật này, phản ứng PCR được thực hiện với đoạn mồi đặc hiệu (mồi ngược) được thiết kế mang vị trí cắt của enzyme giới hạn xác định (ví dụ BspHI..) [78]. Sản phẩm PCR thu được sẽ được xử lý bằng enzyme giới hạn tương ứng với mồi thiết kế. Enzyme giới hạn BspHI [33] hoặc BclI [78] sẽ cắt sản phẩm PCR tại với vị trí xác định có trình tự tương ứng với vi rút không mang đột biến kháng thuốc (vi rút nhạy cảm với thuốc), trong trường hợp vi rút mang gen kháng thuốc, sản phẩm PCR sẽkhông được cắt bởi enzyme giới hạn.
*Ưu điểm
Kỹ thuật này có thể thực hiện được với số lượng mẫu lớn, giá thành thấp và có thể thực hiện trên bệnh phẩm lâm sàng và vi rút phân lập.
Việc lựa chọn enzyme thích hợp để thiết kế mồi và phân tích sản phẩm PCR không dễ, đặc biệt với các đột biến trên protein neuraminidase (NA) khi bản chất của protein này cũng là một enzyme, vì vậy hiện tượng cắt tại các vị trí không mong muốn (dương tình giả) , hoặc không tạo sản phẩm PCR tương thích... là các vấn đề hay gặp, ảnh hưởng tới độ tin cậy của phương pháp, cần sử dụng kỹ thuật giải trình tựgen đểxác định lại kết quả.
Kỹ thuật giải trình tựđoạn gen ngắn thực hiện với từng nucleotide xác định (pyro- sequencing)
Pyrosequencing là kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới, được ứng dụng lần đầu tiên năm 1996 tại Thụy Điển, đến năm 2001 phương pháp bắt đầu được áp dụng trên thế giới. Pyrosequencing đáp ứng được yêu cầu muốn xác định trình tự gen cho một đoạn DNA nhỏ và có thể thực hiện với sốlượng mẫu lớn trong thời gian ngắn. Mục tiêu chính của phương pháp là xácđịnh các điểm đột biến, ngoài ra có thể sử dụng phương pháp này trong định típ vi sinh vật và được coi là một phương pháp xét nghiệm khẳng định kết quả [88]
*Ưu điểm
Kỹ thuật này mang ưu điểm có thể rút ngắn thời gian giải trình tự khi so sánh với giải trình tự thông thường, có thể áp dụng cho nhiều loại mẫu khác nhau như bệnh phẩm lâm sàng, vi rút đã nuôi cấy và có thể thực hiện với sốlượng bệnh phẩm lâm sàng lớn, phù hợp với tính chất giám sát học [25, 26]. Ngoài ra, phương pháp này còn được ứng dụng trong việc định loại vi sinh vật (tuy không thông dụng) và xác định cá thể mang gen dị hợp, hỗ trợ cho quá trình chẩn đoán trong phòng thí nghiệm [10, 88]
*Nhược điểm
Pyrosequencing có nhược điểm là chỉ thực hiện trên đoạn DNA ngắn và phát hiện được các đột biến được chỉđịnh, nên phạm vi ứng dụng còn hạn chế và chỉ tập
trung vào các nghiên cứu, giám sát cụ thể [25, 88]. Việc phát hiện đột biến liên quan đến kháng oseltamivir bằng phương pháp pyrosequencing chỉ cho phép nhận diện sơ bộ khảnăng kháng thuốc của vi rút, các xét nghiệm tiếp theo để khẳng định khảnăng, mức độ kháng thuốc cần được bổ sung.
Kỹ thuật realtime RT-PCR
Nhằm mục đích có thể phát hiện nhanh vi rút mang gen đột biến trên số lượng bệnh phẩm lớn, kỹ thuật realtime RT-PCR được phát triển và áp dụng. Kỹ thuật này được đưa vào thử nghiệm lần đầu tiên năm 2008 [16] với ứng dụng ban đầu là tìm điểm đột biến H275Y trên phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm A/H1N1. Từ năm 2012, tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo có thể sử dụng kỹ thuật realtime RT-PCR để xác định ban đầu bệnh phẩm nhiễm cúm nghi ngờ có mang gen kháng thuốc.
*Ưu điểm
Kỹ thuật này có thể áp dụng cho bệnh phẩm lâm sàng, có thể thực hiện với số lượng bệnh phẩm lớn, cho kết quả sàng lọc sớm trong vòng 3 giờ [16, 35]. Hơn nữa, realtime RT-PCR có giá thành thấp hơn so với giải trình tự gen cổ điển và pyrosequencing, do đó có thể sử dụng như một biện pháp sàng lọc bệnh phẩm mang vi rút kháng thuốc góp phần phát hiện sớm những trường hợp kháng thuốc trong cộng đồng.
*Nhược điểm
Với kỹ thuật này, đột biến liên quan đến kháng thuốc chỉđược xác định tại một điểm nhất định (H275Y) trên phân đoạn gen mã hóa NA trong đó với kỹ thuật giải trình tự gen cổđiển có thể phát hiện đột biến trên toàn bộđoạn gen. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});