L ời cảm ơn
1.4.4. Giám sát sự kháng thuốc vi rút cúm
Quá trình giám sát kháng thuốc của vi rút cúm đã được thực hiện tại các nước phát triển ở châu Âu và châu Mỹ. Các trường hợp nghi ngờcó liên quan đến kháng thuốc đều được kiểm tra kỹ lưỡng và ghi nhận. Hiện nay, tại Việt Nam phòng thí nghiệm cúm đang tiến hành triển khai giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm dựa trên giám sát sự thay đổi trên phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút với sựgiúp đỡ của TCYTTG. Giám sát được sự kháng thuốc của vi rút cúm góp phần tăng cường năng lực đáp ứng với sự xuất hiện của đại dịch cúm trong tương lai, chủđộng trong quá trình phòng và điều trị bệnh cúm trong đó việc sử dụng thuốc đóng vai trò quan trọng.
Xây dựng quy trình giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm
Tại Việt Nam, ba trong số các kỹ thuật xét nghiệm trình bày ở phần trên đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm cúm viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương là giải trình tự gen, realtime RT-PCR và xác định mức độ kháng thuốc bằng chất màu huỳnh quang. Hiện tại, các phương pháp đều đã được xây dựng quy trình chuẩn (SOP) nhằm tạo tiền đề cho việc thực hiện xét nghiệm giám sát thường xuyên sự kháng thuốc của vi rút cúm tại phòng thí nghiệm.
Chiến lược thực hiện giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm tại phòng thí nghiệm
Giám sát vi rút cúm kháng thuốc tại Việt Nam được bắt đầu từ những năm 2005, tuy nhiên cũng chỉ dừng lại ở những trường hợp đơn lẻ của vi rút cúm A/H1N1, A/H5N1. Những kết quả tìm hiểu sự kháng thuốc của vi rút cúm thu được từđại dịch cúm A/H1N1pdm09 là tiền đềđể phát triển chương trình giám sát kháng thuốc trong tương lai.
Giám sát sự kháng thuốc của vi rút bao gồm sự giám sát sự thay đổi, đột biến liên quan đến kháng thuốc, trên gen của vi rút và sự thay đổi trên kiểu hình tương ứng với kiểu gen. Tại Viện các bệnh truyền nhiễm (NIID)-Nhật Bản, khoảng 5-10% chủng vi rút được lựa chọn ngẫu nhiên để xét nghiệm xác định mức độ kháng thuốc của vi rút [69] bằng phương pháp ức chế neuraminidase. Sự thay đổi trên kiểu gen có thểđược giám sát qua phương pháp giải trình tự gen cổđiển (Sanger sequence) trên các vi rút đã được xác định mức độ kháng thuốc. Các trường hợp nghi ngờ có biểu hiện kháng thuốc nhưng chưa xác định được mức độ kháng thuốc có thể áp dụng phương pháp giải trình tự pyrosequencing thực hiện trên bệnh phẩm lâm sàng [25, 36, 104]. Quy trình giám sát vi rút cúm kháng thuốc được tổ chức giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm (ISIRV) khuyến cáo thực hiện bao gồm quá trình xác định biểu hiện kháng thuốc của các chủng vi rút thông qua kỹ thuật NAI với cơ chất huỳnh quang, sau đó các chủng có biểu hiện kháng thuốc sẽđược xác định vịtrí đột biến liên quan đến kháng thuốc trên gen NA bằng các phương pháp như giải trình tự gen thông thường hoặc realtime RT-PCR. Quy trình này hiện nay đang được áp dụng tại các phòng thí nghiệm tham chiếu của TCYTTG tại CDC-Altanta, Melbourne và NIID-Nhật Bản.
Những kết quả có thể thu được khi thực hiện giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm
Sự kháng thuốc của vi rút nếu được phát hiện sớm tại các bệnh viện sẽ tạo điều kiện cho bác sĩ lâm sàng thay đổi phác đồ điều trị phù hợp, rút ngắn thời gian nằm viện của bệnh nhân. Hơn nữa, việc phát hiện sớm rất có ý nghĩa trong công tác phòng chống dịch khi các trường hợp kháng thuốc được xác định trong thời điểm bùng phát dịch, đặc biệt với các trường hợp là nhóm ca bệnh có liên quan đến kháng thuốc, từ đó có thể áp dụng các biện pháp can thiệp phòng chống vi rút mang gen kháng thuốc lan truyền trong quần thể.
Mỗi vi rút mang gen kháng thuốc có biểu hiện về mức kháng thuốc khác nhau, mức kháng thuốc tăng cao đặc biệt ở vi rút mang đồng thời cả hai loại đột biến liên
quan đến kháng thuốc [38, 74], do vậy, giám sát kháng thuốc để tăng cường khả năng phát hiện và theo dõi được tình trạng kháng thuốc của vi rút và sự tương tác của vi rút với môi trường.
Xu hướng lưu hành vi rút cúm tại Việt Nam khác với các nước ở vùng khí hậu hàn đới, nơi có mùa cúm rõ ràng, khi có hai đỉnh dịch cúm B vào tháng 2-3 và cúm A vào tháng 7-8 [1] . Nghiên cứu về đặc điểm kháng nguyên của vi rút cúm cho thấy dường như vi rút cúm lưu hành tại Việt Nam có đặc điểm gần giống với các chủng vi rút cúm lưu hành tại Nam bán cầu [106]. Do đó với các chủng mang đột biến kháng thuốc sẽđược giám sát sự tiến hóa trong quá trình tiến hóa chung của vi rút cúm, từ đó có thể xác định được kiểu gen và kiểu hình đặc thù của vi rút cúm lưu hành tại Việt Nam.
CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng cúm A bao gồm các phân típ A/H1N1, A/H1N1pdm09, A/H3N2 và A/H5N1 phân lập được tại PTN Cúm, viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương từ năm 2001 đến 2012 từ các nguồn sau:
- Giám sát phòng thí nghiệm 2001 – 2005: Vi rút phân lập từ các bệnh nhân có hội chứng cúm theo giám sát của phòng thí nghiệm (sốt trên 38oC, ho và/hoặc đau họng)
- Chương trình giám sát cúm quốc gia 2006 – 2012: Vi rút phân lập từ các bệnh nhân có hội chứng cúm trong chương trình giám sát cúm Quốc gia phối hợp với US-CDC với tiêu chuẩn: sốt trên 38oC, ho và hoặc đau họng và không có chẩn đoán nào khác.
- Giám sát viêm phổi nặng 2003 – 2012 (vi rút A/H5N1): Vi rút phân lập từ các bệnh nhân viêm phổi nặng khi có đầy đủ triệu chứng của hội chứng cúm kèm theo khó thở, có chỉđịnh áp dụng hỗ trợ hô hấp, hình ảnh X-quang phổi có tổn thương đặc hiệu cho viêm phổi do vi rút và không hướng đến căn nguyên nào khác ngoải vi rút.
Các chủng cúm A được thu thập tại các tỉnh phía Bắc gồm Lạng Sơn, Hòa Bình, Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Bắc Ninh, Ninh Bình, Hưng Yên, Thái Bình và Thanh Hóa.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Toàn bộ các vi rút cúm mùa A/H1N1, A/H1N1pdm09, A/H3N2 và A/H5N1 sau khi phân lập được xác định mức độ kháng thuốc bằng phương pháp ức chế neuraminidase, các vi rút có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir sẽ được giải trình tự phân đoạn gen mã hóa NA để xác định điểm đột biến liên quan đến
kháng thuốc và phân đoạn gen mã hóa HA để xác định sự tiến hóa của vi rút [46, 112, 113]. Tuy nhiên, để thực hiện mục tiêu của nghiên cứu về sự tiến hóa của vi rút, toàn bộ chủng cúm A trong nghiên cứu được giải trình tự hai phân đoạn gen mã hóa HA và NA.
2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm 2.3.1. Vật liệu
2.3.1.1. Chủng vi rút
Cỡ mẫu trong nghiên cứu được xác định là cỡ mẫu toàn bộ 342 chủng bao gồm: 42 chủng H1N1 thu thập từ năm 2001 đến 2009; 157 chủng H1N1pdm09 thu thập từtháng 6 năm 2009 đến 2012; 115 chủng H3N2 thu thập từnăm 2003 đến 2012 và 28 chủng H5N1 thu thập từnăm 2004 đến 2012
Các chủng cúm thu thập theo năm được sử dụng trong nghiên cứu
Năm Sốlượng chủng A/H1N1 A/H1N1 pdm09 A/H3N2 A/H5N1 2001 8 - 0 - 2002 4 - 0 - 2003 14 - 4 1 2004 - - 13 4 2005 - - 2 3 2006 3 - 0 - 2007 - - 16 8 2008 7 - 1 5 2009 6 86 36 4 2010 - 13 12 3 2011 - 58 1 - 2012 - - 30 - Tổng 42 157 115 28 342
2.3.1.2. Tế bào
Tếbào thường trực thận chó MDCK (Madin – Darby Canine Kidney) có nguồn gốc từ trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ (US-CDC)
2.3.1.3. Sinh phẩm
Sinh phẩm cho phương pháp phân lập vi rút
Sinh phẩm Xuất xứ
Tế bào Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) US-CDC
Chai nuôi cấy tế bào T-75 Corning Cat.No. 430720 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) GIBCO Cat.No. 11965-092 Penicillin-Streptomycin, dạng dung dịch đặc
(10,000 U/ml penicillin G; 10,000 μg/ml streptomycin sulfate)
GIBCO Cat.No. 15140-023
Dung dịch Bovine serum albumin fraction V, 7.5% GIBCO Cat.No. 15260-011 Fetal bovine serum, 40 nm filtered HyClone Laboratories, Inc
Cat.No. A-1111-L Trypsin-EDTA
(0.05% trypsin; 0.53 mM EDTA.4Na)
GIBCO Cat.No. 25300-054
Trypsin, TPCK Sigma Cat.No. T-8642
Gentamicin reagent dạng dung dịch (50mg gentamicin sulfate/ml)
GIBCO Cat.No 15750-011
Cồn (96-100%) Merck Cat.No.1.00983.1000
Sinh phẩm cho phương pháp giải trình tự gen
* Tạo đoạn DNA bổ sung
- Enzyme Superscript III reverse transcriptase – Invitrogen (Mã catalog 18080085).
* PCR - PCR kit
- Qiagen HotStar Hifidelity (Mã catalog 202602) - Qiagen One step RT-PCR (Mã catalog 210212) - Mồi cho PCR và giải trình tựphân đoạn gen mã hóa NA
Mồi Trình tự Hướng
Ba-NA-1F AGCGAAAGCAGGAGT Xuôi
Ba-NA-1413R AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT Ngược
N1-780F GGGGAAGATTGTYAAATCAGTYGA Xuôi
N1-1273R CWACCCAGAARCAAGGYCTTATG Ngược
- Mồi cho PCR và giải trình tựphân đoạn gen mã hóa HA
Phân típ cúm Mồi Trình tự Hướng
H5HA
H5-3F CTC GGA AAC CCA ATG TGT GAC Xuôi
H5-R1 GAC AGT ATT TGG TAA ATT CC Ngược
H5-5R GGA CTC AAG AAT TAT GAA AAG TG Xuôi
H5-3R CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG Ngược
H1HA và
H1pdm09 HA
Bm-HA-1F AGCGAAAGCAGGGG Xuôi
Bm-NS-890R AGTAGAAACAAGGGTGTTTT Ngược
* Tinh sạch sản phẩm
- Kit làm tinh sạch sản phẩm PCR (khi sản phẩm PCR thu được một băng đặc hiệu) của hãng Qiagen: Purification kit Qiaquick (250) Mã catalog 28106
- Kit làm tinh sạch sản phẩm PCR (khi sản phẩm PCR thu được một gồm nhiều băng không đặc hiệu, trong số đó có băng là sản phẩm mong muốn) của hãng Qiagen: Qiaquick Gel Extraction kit (250) Mã catalog 28706
- Kit làm tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide của hãng Qiagen: DyeEx 2.0 Spin kit Qiagen Mã catalog 63206
* Giải trình tự gen
- Kit BigDye Terminator v3.1 ABI. Mã catalog 4336917 - Polymer: POP 7 ABI. Mã catalog 4352759
Sinh phẩm cho phương pháp xác định nồng độ oseltamivir ức chế
neuraminidase
- 2-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) (Sigma-Aldrich Mã catalog M3671) - Oseltamivir Carboxylate (Roche. GS4071)
- Zanamivir (Glaxo-Smithkline. GR121167X)
- MUNANA [2’ 2’-(4-Methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid sodium salt hydrate] (Sigma - Aldrich Mã catalog M8639)
2.3.1.4. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị
Thiết bị Xuất xứ
Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 3 Viện Vệ sinh Dịch tễTrung ương Tủ an toàn sinh học cấp 2 Bioquell – Anh
Máy khuếch đại gen Biorad – Mỹ
Máy giải trình tự gen ABI3130 Hitachi – Nhật Máy đọc tín hiệu huỳnh quang Perkin Elmer – Mỹ
Máy ly tâm Beckman Coulter – Mỹ
Dụng cụ
Dụng cụ sử dụng trong các thí nghiệm bao gồm: - Pipet vi lượng 10µl - 1000µl
- Đầu côn có lọc vô trùng 10µl - 1000µl - Phiến nuôi cấy tế bào 25cm2, 75 cm2
- Phiến 96 giếng màu đen đáy phẳng - Tuýp Eppendorf 1,5ml – 2ml Và các dụng cụ khác.
2.3.2. Kỹ thuật xét nghiệm 2.3.2.1. Phân lập vi rút Chuẩn bị
- Tế bào MDCK mọc đẹp thành một lớp trong tuýp nuôi cấy tế bào.
- Dung dịch phát triển gồm: D-MEM x10, Fetal Bovine Serum 7,5%, Penicillin 100 U/ml và Streptomycin 100 µg/ml , NaHCO3 và nước cất hai lần vô trùng.
- Dung dịch môi trường nuôi cấy vi rút gồm:D-MEM x10, Bovine serum albumine 2%, Penicillin 100 U/ml và Streptomycin 100 µg/ml , TPCK- treated trypsin và nước cất hai lần vô trùng.
Các vi rút cúm A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H3N2 được phân lập tại PTN ATSH cấp 2, vi rút A/H5N1 được phân lập tại PTN ATSH cấp 3
Tiến hành
- Cho 250 µl bệnh phẩm vào phiến nuôi cấy có tế bào MDCK, ủ 60 phút tại nhiệt độ 33oC, thêm 1,5ml môi trường nuôi cấy, quan sát sự huỷ hoại tế bào (CPE) qua kính hiển vi lộn ngược trong vòng 1-2 tuần.
- Xác định típ và phân típ của chủng vi rút bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HAI) có sử dụng các kháng huyết thanh chuẩn của tổ chức y tế thế giới.
- Phương pháp RT-PCR với các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng thêm để xác định típ và phân típ của chủng vi rút cúm A
2.3.2.2. Xác định mức độ kháng thuốc của vi rút cúm với oseltamivir Nguyên lý
Kỹ thuật xác định mức độ nhạy cảm với oseltamivir bao gồm 2 bước: xác định mức độ hoạt động của neuraminidase và xác định độ nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir bằng phản ứng ức chế neuraminidase (NA). Kỹ thuật này dựa trên
Bệnh phẩm dịch họng thu thập từ bệnh nhân RT-PCR với các mồi đặc hiệu Âm tính Dương tính CPE dương tính Giá trị HA ≤ 8 Kiểm tra lại bằng RT-PCR Giá trị HA ≥ 8 Định týp bằng phản ứng HAI Nuôi cấy trên tế bào MDCK CPE âm tính Cấy chuyển 3 lần, nếu CPE âm tính, bệnh phẩm âm tính
nguyên lý hoạt động của NA. Dưới tác dụng của NA, axit sialic phân tách với nhóm đường, giải phóng vi rút cúm khỏi bề mặt tế bào cảm nhiễm. Do vậy, ức chế sự phân tách này sẽ cản trở quá trình giải phóng vi rút cúm, ngăn chặn sự phát tán của vi rút trong cơ thể. MUNANA [2’ 2’-(4-Methylumbelliferyl)-α-D-N- acetylneuraminic acid sodium salt hydrate] là chất nền huỳnh quang được sử dụng trong thử nghiệm xác định mức độ nhạy cảm với oseltamivir và mức độ hoạt động của neuraminidase của vi rút cúm. Trong phản ứng này, MUNANA sẽ bị phân tách bởi NA, giải phóng phân tử phát huỳnh quang 4-Methylumbelliferyl (4-MU) và được đọc bởi máy đọc tín hiệu huỳnh quang.
Xác định mức độ hoạt động của neuraminidase
Đây là bước xác định mức độ hoạt động của neuraminidase mà qua đó có thể xác định được mức phát quang chuẩn, từ đó có thể dựa vào để xác định độ pha loãng của vi rút trong phản ứng ức chế neuraminidase tiếp theo.
Chất nền MUNANA được đưa vào dung dịch chứa vi rút đã được pha loãng bậc hai bằng dung dịch đệm. Ủ hỗn hợp tại 37oC trong 60 phút, thêm chất dừng phản ứng, đọc bằng máy đọc tín hiệu huỳnh quang.
Kỹ thuật được thực hiện 3 lần trong cùng một thời điểm để hạn chế sai số.
Phản ứng ức chế neuraminidase
Độ nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir được xác định bởi giá trị IC50 của vi rút. Giá trị thể hiện nồng độ oseltamivir mà tại đó ức chếđược 50% vi rút cúm.
Oseltamivir được pha loãng theo các nồng độ từ40000nM đến 0.04nM rồi cho vào dung dịch vi rút đã pha loãng dựa trên các giá trịthu được từ phản ứng xác định mức độ hoạt động neuraminidase nói trên, ủ 37oC/30 phút trong tủ ấm. Sau đó cho MUNANA vào hỗn dịch, ủ 37oC/60 phút trong tủ ấm. Đọc tín hiệu huỳnh quang trên máy VICTOR X2 trong vòng 20 phút sau khi dừng phản ứng (Sơ đồ 2.2).
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần tại cùng một thời điểm để hạn chế sai số. Với các chủng A/H5N1 thí nghiệm sẽđược thực hiện tại phòng thí nghiệm an toàn sinh học (ATSH) cấp 3. Các chủng cúm A/H1N1, A/H1Npdm09 được thực hiện tại phòng thí nghiệm ATSH cấp 2.
Xác định giá trị IC50
bằng phần mềm JASPR
Đọc kêt quả tại bước sóng 355/460nm Xác định độ pha loãng của từng vi rút Ủ 37oC/45 phút + 50µl dung dịch MUNANA Ủ 37oC/60 phút Dừng phản ứng Ủ 37oC/60 phút Dừng phản ứng
Đọc kêt quả tại bước sóng 355/460nm Chủng cúm A phân típ H1N1, H1N1pdm09, H3N2 và H5N1 Xác định hoạt động của neuraminidase
+ 50µl vi rút được pha loãng bậc hai bằng dung dịch đệm + 50µl dung dịch MUNANA + 25µl vi rút đã được pha loãng bằng dung dịch đệm + 25µl oseltamivir pha loãng theo nồng độ 0-