L ời cảm ơn
1.4.3.Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của
neuraminidase
Đây là quá trình cần thiết đểxác định mức độ kháng oseltamivir của vi rút cúm đươc thực hiện dựa trên nguyên lý hoạt động của neuraminidase chứng minh cho việc phát hiện đột biến liên quan đến kháng thuốc trên gen là chính xác. Kỹ thuật bao gồm hai bước chính: xác định hoạt động của neuraminidase và xác định mức độ kháng thuốc oseltamivir hoặc zanamivir.
Xác định hoạt động của neuraminidase
Mục đích của việc xác định hoạt động của neuraminidase là đánh giá hoạt động của enzyme trong quá trình nhân lên của vi rút và chuẩn hóa nồng độ vi rút trước khi thực hiện việc xác định mức độ kháng thuốc của vi rút.
Xác định mức độ kháng oseltamivir/zanamivir
*Dựa trên hoạt động của neuraminidase với chất phát quang có nguồn gốc hóa học
Việc nhận định mức độ kháng thuốc oseltamivir/zanamivir của vi rút cúm dựa vào sự phát quang của chất có nguồn gốc hóa học (chemiluminesence). Kết quả thu được từ kỹ thuật này được đánh giá có đủ độ tin cậy và được sử dụng tại nhiều phòng thí nghiệm (PTN) chuẩn thức trên thế giới như PTN tại trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ (US-CDC), PTN tại Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia Nhật Bản (NIID) [73, 104]. Các bộkit xác định mức độ kháng thuốc có chất phát quang có nguồn gốc quang học được Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo sử dụng là NA- Star và NA-XTD hãng Applied Biosystem, Mỹ [111].
Ưu điểm
Đây là kỹ thuật xác định mức độ kháng thuốc có độ nhạy cao, có thể sử dụng với các vi rút có nồng độ thấp, cùng một lúc có thể thử nghiệm với nhiều loại thuốc khác nhau và là kỹ thuật hỗ trợ khẳng định sự kháng thuốc của vi rút cúm.
Nhược điểm
Do có độ nhạy cao nên kỹ thuật không nhận định được rõ ràng kết quả nếu mẫu thử nghiệm là vi rút không đột biến hoàn toàn . Hơn nữa, để sử dụng hiệu quả cần phương tiện hỗ trợđặc biệt (bộ phận chứa phiến 96 giếng, bộ phận chia dung dịch dừng phản ứng tựđộng gắn liền với máy) cho máy đọc kết quả do chất phát sáng có nguồn gốc hóa học này dễ bị phân hủy khi gặp ánh sáng và giá thành tương đối cao so với kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của neuraminidase với chất phát huỳnh quang.
*Dựa trên hoạt động của neuraminidase với chất phát quang là huỳnh quang
Đây là kỹ thuật xác định độ nhạy cảm của neuraminidase với thuốc ức chế hoạt động của enzyme (oseltamivir, zanamivir...) có sử dụng chất huỳnh quang trong thành phần của phản ứng. Kết quả của thử nghiệm xác định được nồng độ thuốc ức chế 50% hoạt động của vi rút. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các PTN do khảnăng ứng dụng linh hoạt trong sử dụng hóa chất sinh phẩm và được tổ chức y tế thế giới khuyến cáo sử dụng xác định mức độ kháng thuốc của các chủng vi rút [111].
Ưu điểm
Ưu điểm của kỹ thuật là thời gian tiến hành nhanh, kết quả có thể phân định được rõ ràng chủng nhạy cảm và chủng kháng thuốc [14]. Ngoài ra, không giống kỹ thuật NAI dựa vào sự phát quang của chất có nguồn gốc hóa học đề cập ở trên, kỹ thuật này cho phép sử dụng sinh phẩm là bộ kit thương mại, NA Fluor kit, Applied Biosystem hoặc các hóa chất sinh phẩm có sẵn tại phòng thí nghiệm sử dụng chất phát quang MUNANA của hãng Sigma.
Nhược điểm
Độ nhạy của kỹ thuật không được đánh giá cao như kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir/zanamivir dựa trên hoạt động của neuraminidase với chất phát
quang có nguồn gốc hóa học [111]. Do đó, để khẳng định lại những chủng vi rút nghi ngờ về khả năng kháng thuốc, cần sử dụng kỹ thuật NAI sử dụng chất phát quang có nguồn gốc hóa học.