1.3. Phương pháp xác định SB, DSB và DDSB
1.3.2. Phương pháp phân tích
Daniela F. Maluf và các cộng sự đã phát triển phương pháp UV-Vis để định lƣợng sibutramine hydrochloride monohydrate trong viên nang. Mẫu phân tích đƣợc hòa tan trong nước (n=3) và được đo ở bước sóng 223,0 nm trên thiết bị quang phổ hấp thụ phân tử UV-1601 PC, Shimazdzu, Kyoto, Japan, khoảng bước sóng từ 200 nm đến 800 nm. Đường chuẩn xây dựng được có hệ số tương quan là 0,9997, khoảng tuyến tớnh từ 5,0 đến 30,0 àg/mL. Độ chớnh xỏc lần lƣợt là 101,4 ± 1,2%, 99,1 ± 0,9% và 102,2 ± 1,9% tương ứng với cỏc nồng độ 10,0, 20,0 và 30,0 àg/mL.
Độ tái lặp và lặp lại được thể hiện qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) tương ứng là 1,4359 và 1,9234. Ưu điểm của phương pháp UV-Vis là đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp. Tuy nhiên, phương pháp chỉ định lượng SB, không xác định đồng thời SB và các dẫn xuất của SB [26].
1.3.2.2. Phương pháp điện di mao quản
Danwang và cộng sự đã xây dựng phương pháp điện di mao quản phát hiện đƣợc đồng thời sibutramine và phenolphthalein có trong mẫu thực phẩm chức năng.
Dung dịch đệm đƣợc sử dụng là hỗn hợp đệm phosphate 20 mM và natri dodecyl sulphate 20 mM (pH = 11). Chất phân tích được phát hiện ở bước sóng 223 nm, điện thế 25 kV ở 20oC. Giới hạn phỏt hiện của sibutramine là 0,03 àg/mL, phenolphthalein là 0,18 àg/mL. Khoảng tuyến tớnh của sibutramine là 0,1 – 50 àg/mL, phenolphthalein là 0,8 – 50 àg/mL. Độ thu hồi của 2 chất tương ứng là 95,3% và 103,4% [38].
Nhóm tác giả Yang Li và các cộng sự đã phát triển phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao để xác định đồng thời 07 hoạt chất trong mẫu thực phẩm chức năng là fenfluramin, pseudoephedrine, norpseudoephedrine, amfepramone, sibutramine, sildenafil và strychnine. Sử dụng hỗn hợp đệm của natri tetraborate 20
14
mM, natri dodecyl sulfat 10 mM và acetonitrile 5% (pH=9,0), bước sóng phát hiện là 195 nm, điện áp tách là 17kV ở 25oC. Giới hạn trên của đường chuẩn là 100 mg/L với hệ số tương quan R lớn hơn 0,998. Độ lệch chuẩn tương đối dao động từ 4,5 và 7,9% (n=7). Độ thu hồi trung bình trong khoảng 79,6% - 112,0%. Giới hạn phát hiện (S/N=3) nằm trong khoảng 0,16 và 0,65 mg/L. Phương pháp đã được áp dụng thành công cho việc xác định 7 hoạt chất trong mẫu thực phẩm chức năng [25]. Tuy nhiên giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp cao, phương pháp cũng chưa xây dựng để xác định đồng thời sibutramine và một số dẫn xuất.
Shigeki Akamatsu và Takao Mitsuhashi (2013) đã sử dụng phương pháp điện di mao quản khối phổ hai lần để xác định đồng thời 20 thành phần dƣợc phẩm trong thuốc nhuận tràng và thuốc ức chế sự thèm ăn trong đó có SB, DDSB, phenolphthalein. Kết quả cho thấy LOD của các chất dao động từ 1,0 – 750 μg/g với tuỳ chất [5].
1.3.2.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao – HPTLC
Phương pháp HPTLC đã được phát triển và được áp dụng để xác định sibutramine trong mẫu thực phẩm bổ sung dạng thảo dƣợc.
Trong nghiên cứu của Mathon C và các cộng sự, tác giả đã sử dụng phương pháp HPTLC-UV để định lƣợng sibutramine trong thực phẩm bổ sung dạng thảo dƣợc. Dịch chiết mẫu đƣợc chấm trực tiếp lên bản mỏng silica gel HPTLC, pha động là hỗn hợp toluene-methanol. Sibutramine được định lượng ở bước sóng 225nm và đƣợc xác minh bởi detector khối phổ MS. Trong hai cuộc điều tra, 52 mẫu thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân đã đƣợc sàng lọc. Một nửa trong số đó phát hiện có pha trộn với sibutramine, hàm lƣợng lên tới 35 mg/ viên. Kết quả thu nhận được từ phương pháp HPTLC được so sánh với kết quả thu được khi thực hiện phép phân tích bằng phương pháp HPLC-UV và HPLC-MS/MS. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa ba phương pháp [27].
Hayun và các cộng sự đã xác định sibutramine trộn trái phép trong sản phẩm thảo dược giảm cân, trong nghiên cứu, tác giả sử dụng phương pháp đo mật độ phổ lớp mỏng (TLC) với pha tĩnh là bản mỏng nhôm TLC silica gel 60 F254, pha động là hỗn hợp toluene-diethylamine (10:0,3, v/v). Đường chuẩn xây dựng có khoảng định lượng từ 0,50 đến 5,00 àg/mL, hệ số tương quan R2= 0,9986. Giới hạn phỏt hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 217,5 ng và 724,9 ng. Phương
15
pháp sau khi thẩm định đƣợc sử dụng để xác định hàm lƣợng sibutramine trong sản phẩm thảo dƣợc giảm cân đƣợc lấy từ một số nhà thuốc ở thành phố Depok, Indonesia. Kết quả định lƣợng cho thấy có 6 trong 7 mẫu phân tích chứa sibutramine HCl với hàm lƣợng từ 2,45 - 26,24 mg/viên [15].
Phattanawasin P và cộng sự đã xây dựng phương pháp phân tích sắc ký lớp mỏng để xác định nhanh và định lƣợng sibutramine HCl trộn trái phép trong sản phẩm thảo dƣợc giảm cân. Pha tĩnh là bản mỏng silicagel 60 F254, pha động là hỗn hợp dung môi toluene-n-hexane-diethylamine (9:1:0,3. v/v/v), Dragendorff đƣợc sử dụng là thuốc thử hiện màu. Đường chuẩn được xây dựng có dải nồng độ từ 1 àg/mL - 6 àg/mL. LOD và LOQ tương ứng là 190 và 634 ng/g [31].
Phương pháp HPTLC đã được phát triển thường sử dụng để định tính sibutramine. LOD và LOQ trong trường hợp định lượng thấp hơn phương pháp UV- VIS và điện di mao quản, tuy nhiên các nghiên cứu cũng chỉ xác định sibutramine mà không xác định đồng thời sibutramine và dẫn xuất của sibutramine.
1.3.2.4. Phương pháp sắc ký khí (GC-MS)
Để xác định đồng thời sibutramine và một số dẫn xuất, phương pháp GC-MS đã đƣợc nghiên cứu và phát triển.
Tác giả Sabina Strano-Rossi và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc kí khí khối phổ nhằm xác định các chất chuyển hóa của sibutramine trong nước tiểu. Mẫu nước tiểu được tiền xử lý bằng phương pháp chiết lỏng/ lỏng, thủy phân enzyme…, ủ nhiệt và chiếu xạ vi sóng. Sản phẩm chuyển hóa của sibutramine bao gồm: mono desmethyl sibutramine, didesmethyl sibutramine…. Các chất chuyển hóa này đƣợc phát hiện rõ ràng trong khoảng nồng độ 10 đến 50 ng/mL, đáp ứng các giới hạn hiệu suất tối thiểu cần thiết (MRPL) của Cơ quan chống doping thế giới (WADA) [36].
Tại Iran, Khazan và cộng sự đã tiến hành lấy 8 mẫu giảm cân dạng thảo dƣợc trên thị trường. Bằng phương pháp GC-MS và LC-MS, tác giả đã xác định được sự có mặt của sibutramine, phenolphthalein, bumetanide và phenytoin. Các thành phần này không đƣợc công bố trên nhãn của sản phẩm. Kết quả định tính có ý nghĩa quan trọng. Lí do, tại Iran, sibutramine vẫn đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị giảm cân.
Liều khuyến cáo là 5 – 15mg/ngày, tuy nhiên mẫu thảo dƣợc giảm cân có liều là 2 đến 3 viên/ 1 ngày. Do đó, nếu những bệnh nhân sử dụng thuốc sibutramine kết hợp với thực phẩm giảm cân thảo dƣợc có chứa sibutramine sẽ dẫn đến tình trạng quá liều, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe [21].
16
1.3.2.5. Phương pháp sắc ký lỏng và sắc ký lỏng khối phổ
Zhou Yu và cộng sự xây dựng phương pháp xác định đồng thời 4 hoạt chất cấm bao gồm orlistat, cetilistat, sibutramine và rimonabant trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Các chất phân tích được tách và định lượng bởi phương pháp HPLC-PDA ở bước sóng 222 nm. Sự phân tách các chất phân tích được thực hiện bằng việc sử dụng chế độ gradient rửa giải gồm acetonitrile và acid phosphoric 0,02 mol/L, cột sắc ký C18. Độ thu hồi nằm trong khoảng 96,1% đến 97,2%. Độ tái lặp trong ngày và giữa các ngày thay đổi nhỏ hơn 1%. Giới hạn phát hiện là 189 ng/g, đường chuẩn đƣợc xây dựng có độ tuyến tính tốt R2 > 0,999 [42].
H. Rebiere cùng với nhóm nghiên cứu của mình đã xây dựng phương pháp HPLC để định tính một số hoạt chất cấm trong thực phẩm hỗ trợ giảm béo. Tác giả sử dụng cột C18, detector mảng diode, pha động là gradient của 2 kênh A và B.
Trong đó kênh A là đệm phosphate 50mM, đƣợc điều chỉnh về pH = 3,8 bởi H3PO4 10% và kênh B là acetonitril. Kết quả, phát hiện 32 / 34 mẫu thực phẩm hỗ trợ giảm béo có chứa: caffeine, clenbuterol, nicotinamide, phenolphthalein, rimonabant, sibutramine, didesmethyl sibutramine, synephrine và yohimbine.
A.P. Suthar và cộng sự đã xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC pha đảo để định lƣợng sibutramine trong viờn nộn. Sử dụng cột C18, 5 àm, 250 x 4.6 mm, chế độ đẳng dòng, pha động ACN : Amoni dihydro photphat 50 mM (65:35, v/v; pH 6). Tốc độ dòng 1 mL/ phút, bước sóng 225 nm. Thời gian lưu của sibutramine là 6,18 phỳt. LOD và LOQ tương ứng 0,09 àg/mL và 0,26 àg/mL. Hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 99,87 – 100,45 % [37].
Tarita Kamardi và các cộng sự tại viện Kỹ thuật Bandung đã lựa chọn kỹ thuật chiết pha rắn (pha đảo) SPE - HLB để phát triển và tối ưu hóa phương pháp xác định sibutramine HCl trong sản phẩm thảo dƣợc. Mẫu sau khi đƣợc chiết qua cột SPE, dịch thu đƣợc sẽ đƣợc đem phân tích trên thiết bị HPLC, cột C18 với detector PDA. Phương pháp đã được thẩm định và được sử dụng để phân tích xác định hàm lƣợng sibutramine HCl trong thực phẩm chức năng hỗ trợ giảm cân dạng thảo dược thu nhận trên thị trường. Sibutramine HCl được detector thu nhận ở bước sóng 222 nm. Khoảng tuyến tính nằm trong khoảng từ 0,10 đến 0,50 mg/mL, R2 = 0,9966. Giới hạn định lượng của phương phỏp là 2,326 àg/g. Độ đặc hiệu của phương pháp là khá tốt. Độ phân giải các thành phần chất có trong mẫu:
17
diethylpropion là 2,415; sibutramine HCl là 2,877 và amphetamine sulfate là 5,673 [18].
Tác giả Nguyễn Tiến Luyện (2014) cũng đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA để xác định sibutramine trong TPBVSK dạng viên nang, sử dụng cột C18 (250 x 4,6 mm, cỡ hạt 5 μm ở nhiệt độ 30 độ C), tốc độ dòng 1 mL/phút, detector PDA ở bước sóng 225nm, pha động sau khi nghiên cứu tối ƣu với kênh A là KH2PO4 0,05M pH = 4 và kênh B là ACN. Nghiên cứu đã xác định đƣợc sibutramine trong một số mẫu TPBVSK với giới hạn phát hiện là 0,2 μg/mL và giới hạn định lƣợng là 0,5 μg/mL [2].
So với các phương pháp khác, phương pháp HPLC có ưu điểm là đơn giản, thời gian phân tích ngắn, khả năng ứng dụng tốt, tuy nhiên đối với một số nền mẫu phức tạp nhƣ nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe, việc định lƣợng các chất trở lên khó khăn. Một số chất tương tự nhau, có thể không tách ra khỏi nhau, do đó không thể định lượng được. Kết hợp ưu điểm của phương pháp GC-MS và HPLC, LC- MS/MS đã đem lại nhiều ứng dụng.
Nhóm tác giả tại trường đại học Fudan, Thượng Hải đã thành công trong việc xây dựng phương pháp xác định chất chuyển hóa của sibutramine trong huyết tương là DDSB bằng phương pháp sắc ký lỏng HPLC ghép nối khối phổ (MS/MS). Mẫu được chiết tách từ huyết tương bởi methyl tert-butyl ether, thêm nội chuẩn propranolol, điều chỉnh pH bằng dung dịch natri hydroxid, tiến hành bay hơi dung môi. Phần cắn sẽ đƣợc hòa tan bởi dung môi pha động và đƣợc tiêm vào hệ thống LC-MS/MS. Quá trình sắc ký đƣợc diễn ra trên cột ODS MS với pha động bao gồm acetonitrile (chứa 0,1% trifluoroacetic axit, v/v) (55:45, v/v), tốc độ dòng 0,3 mL/phút. Khoảng tuyến tính: 0,328 - 32,8 ng/mL, độ chính xác thu đƣợc nhỏ hơn 19,90% trên nền mẫu huyết tương, trên toàn bộ khoảng nồng độ. Phương pháp nhạy và độ lặp tốt đƣợc sử dụng trong nghiên cứu dƣợc động học [9]. Cũng trong năm đó, Ding et al cũng xây dựng phương pháp xác định SB và chất chuyển hóa của SB trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS với việc sử dụng thêm nội chuẩn phenoprolamine hydro chloride. Phương pháp xây dựng có đường chuẩn SB, DSB tuyến tính trong khoảng 0,05 – 20,0 ng/mL; đường chuẩn DDSB tuyến tính trong khoảng 0,1 – 30 ng/mL [12].
Helena và các cộng sự đã phát triển phương pháp LC-MS/MS để phân tích sibutramine, một thành phần đƣợc trộn trái phép trong thực phẩm bổ sung. Mẫu
18
đƣợc chuẩn bị đơn giản. Quá trình tách đƣợc thực hiện bởi cột pha đảo, pha động là hỗn hợp acetonitrile và nước (1:1, v/v), acid formic 0,1%, tốc độ dòng 0,4 mL/phút, nhờ đó có thể xác định hàm lượng của sibutramine. Phương pháp được thực hiện có độ đúng, độ chính xác, hiệu quả và độ nhạy cao. Giới hạn định lƣợng là 4,0 ng/g, giới hạn phát hiện là 1,3 ng/g. Khoảng tuyến tính là 5,0 - 30,0 ng/mL, trong khoảng nồng độ này, hệ số tương quan là 0,9984. Phương pháp được công bố có thể được sử dụng để phân tích thường qui [41].
Một nghiên cứu khác của ZiqiangHuang, tác giả đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (HPLC-UV-ESI-MS) để xác định đồng thời các chất cấm sibutramine và sản phẩm chuyển hóa của nó là N-di-desmethylsibutramine trong thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân. Cột tách đƣợc sử dụng là cột pha đảo C8 Spherisorb, pha động là hỗn hợp acetonitrile và axit focmic 0,2% chứa muối amoni acetat 20mM, chế độ gradient. Detector đƣợc sử dụng cho định lƣợng đƣợc cài đặt ở bước sóng 223 nm. Mảnh định lượng của sibutramine là m/z 280 và N-di- desmethylsibutramine là m/z 252. Khoảng tuyến tính của đường chuẩn là 0,025-1,0 mg/mL đối với sibutramine và N-di-desmethylsibutramine. Hệ số tương quan thu đƣợc lớn hơn 0,9990. Độ lặp lại và độ tái lặp đối với sibutramine và N-di- desmethylsibutramine nằm trong giới hạn cho phép. Phương pháp được sử dụng thành công trong phân tích các mẫu thực phẩm bổ sung tự nhiên [16].
S.H. Roh và cộng sự đã nghiên cứu cách xác định đồng thời ba chất ức chế PDE-5 (sildenafil, vardenafil và tadalafil), sibutramine và hai chất chuyển hóa chính của sibutramine là N-desmethylsibutramine và N-didesmethylsibutramine bằng phương pháp sắc ký lỏng UPLC ghép nối khối phổ tứ cực theo thời gian bay (Q- TOF MS) trong thực phẩm bổ sung. Điều kiện pha động của LC là kênh A (acid formic 0,1%), kênh B (acid formic 0,1% trong Acetoniltril), tốc độ dòng 0,2 mL/
phút. Phương pháp này đã sử dụng phổ khối có độ chính xác cao của 6 hợp chất để nhận dạng và có thời gian phân tích ngắn. Độ thu hồi nằm trong khoảng từ 87% đến 113%. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thu được tương ứng 0,4 đến 2,0 mg/kg và 1,3 đến 6,0 mg/kg. Đây là phương pháp phân tích nhanh, dễ thực hiện để phát hiện sự có mặt của các chất trộn trái phép trong thực phẩm bổ sung [35].
Mặc dù racemic sibutramine đã đƣợc sử dụng rộng rãi để điều trị béo phì, nhưng phương pháp phát hiện đối quang của nó vẫn chưa được làm sáng tỏ trong huyết tương người. Trong nghiên cứu của W. Kang và cộng sự, tác giả đã thẩm định phương pháp xác định sibutramine và 2 chất chuyển hóa có hoạt tính của SB bằng
19
LC-MS/MS, khoảng tuyến tính của đường chuẩn nằm trong dải nồng độ 0,1 – 0,8 ng/mL. Các đồng phân R và S của những hợp chất đó trong huyết tương người được chiết bằng dietyl ete – hexan (4:1, v/v) có thêm NaOH. Sau khi loại bỏ lớp hữu cơ, phần cặn đƣợc hòa tan trong pha động. Cả hai đồng phân trong dịch chiết đƣợc tách ra trên cột pha tĩnh Chiralcel AGP và được định lượng bằng phương pháp khối phổ.
Phương pháp nghiên cứu đã được sử dụng thành công để xác định nồng độ các đồng phân lập thể của SB và hai chất chuyển hóa có hoạt tính của SB trong huyết tương theo thời gian ở những người tình nguyện khỏe mạnh [11].
Như vậy, có rất nhiều phương pháp phân tích đã được sử dụng để xác định sibutramine và một số dẫn xuất trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Bảng 1.2 là tóm tắt các kết quả xác định sibutramine và một số dẫn xuất bằng phương pháp GC-MS, HPLC và LC-MS/MS.
Bảng 1.3. Tóm tắt kết quả xác định SB và một số dẫn xuất bằng phương pháp GC- MS, HPLC và LC-MS/MS
Tác giả Nền mẫu
PP phân
tích
Các chất PT Khoảng
nồng độ LOD, LOQ Sabina
Strano (2006) [36]
Mẫu
nước tiểu GC-MS DSB, DDSB và một số
chất chuyển hóa của SB -
LOD nằm trong khoảng 10-50 ng/mg Zhou
Yu (2010)
[42]
TPBVSK HPLC Orlistat, cetilistat,
sibutramine, rimonabant -
LOD: 189 ng/g
H.
Rebiere (2012)
[34]
TPBVSK HPLC
Caffeine, clenbuterol, nicotinamide, phenolphthalein,
rimonabant, sibutramine, didesmethylsibutramine,
synephrine và yohimbine
Định
tính -
20 Tác giả Nền mẫu
PP phân
tích
Các chất PT Khoảng
nồng độ LOD, LOQ A.P.
Suthar (2009) [37]
Viên nén HPLC Sibutramine HCl -
LOD: 0,09 àg/g Tarita
Kamardi (2016)
[18]
Sản phẩm
thảo dƣợc
HPLC Sibutramine HCl
0,10- 0,50 mg/mL
LOQ: 2,326 àg/g
Ding et al.
(2003) [12]
Huyết tương
LC-
MS/MS SB, DSB, DDSB
0,05 – 20,0 ng/mL với SB,
SDB;
0,1 – 30 ng/mL
với DDSB
LOD của SB, DSB và DDSB: 4.5 fg;
3,5 fg; 4,0 fg.
LOQ tương ứng: 31,95;
40,23; 44,12 fg Chen J
(2003) [9]
Huyết tương
LC-
MS/MS DDSB
0,328 - 32,8 ng/mL
LOD: 0,082 ng/mg Helena
(2013) [41]
TPBS LC-
MS/MS SB 5,0-30,0
ng/mL
LOQ: 4,0 àg/kg Ziqiang
Huang (2008) [16]
TPBS hỗ trợ giảm
cân
LC- MS/MS
SB và N-didesmethyl sibutramine
0,025- 1,0 mg/mL
SB: 50 ng/mg;
DSB: 20
ng/mg S.H.
Roh (2011)
[35]
TPBS hỗ trợ giảm
cân
LC- MS/MS
Sildenafil, vardenafil và tadalafil, SB, DSB,
DDSB
-
LOQ: 1,3 - 6,0 mg/kg
21 Tác giả Nền mẫu
PP phân
tích
Các chất PT Khoảng
nồng độ LOD, LOQ W.
Kang (2010)
[20]
Huyết tương
LC- MS/MS
Đồng phân của SB và DSB, DDSB
0,05-20
ng/mL -
Qua bảng 1.3 cho thấy, phương pháp LC-MS/MS được ứng dụng nhiều trong phân tích xác định hàm lƣợng SB, DSB và DDSB trong nền mẫu thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân, giới hạn định lượng của phương pháp thấp hơn so với phương pháp khác. Trong đề tài này, dựa trên điều kiện cho phép của phòng thí nghiệm, nhóm nghiên cứu tiếp tục phát triển phương pháp LC-MS/MS để xác định SB, DSB và DDSB trong mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân, tiến hành tối ƣu hóa quá trình xử lý mẫu, làm sạch mẫu, từ đó làm giảm giới hạn định lƣợng.