Trên cơ sở phương pháp đã xây dựng ở trên, tiến hành thẩm định phương pháp với các thông số cơ bản sau:
Độ đặc hiệu
LOD, LOQ
Khoảng tuyến tính
Độ lặp lại
Độ tái lặp
Độ thu hồi 3.3.1. Độ đặc hiệu 3.3.1.1. Tính số điểm IP
Thực hiện bắn phá các ion mẹ và ghi nhận lại các ion con. Theo cách tính điểm IP, mỗi ion mẹ đƣợc tính là 1 điểm, mỗi ion con là 1,5 điểm. Kết quả thu đƣợc trong bảng 3.1 cho thấy SB, DSB và DDSB đều thu nhận đƣợc 1 ion mẹ và 2 ion con và có số điểm IP = 4 [1], điều này khẳng định sự chắc chắn có mặt của SB, DSB, DDSB trên sắc ký đồ và phương pháp LC-MS/MS được nhóm nghiên cứu lựa chọn có tính đặc hiệu.
3.3.1.2. Tỷ lệ ion
Để khẳng định sự có mặt của các chất phân tích, tiến hành phân tích mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn, so sánh tỷ lệ giữa ion xác nhận và ion định lƣợng, kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Tỷ lệ ion và sai số cho phép
SB DSB DDSB
Mẫu chuẩn 5,0 5,0 5,0
Mẫu thêm chuẩn 4,5 4,1 5,0
% sai lệch cho phép ± 50 % ± 50 % ± 50 %
Khoảng cho phép 4,0 – 6,0 4,0 – 6,0 4,0 – 6,0
Nhận xét Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu
46
Kết quả tỷ lệ ion và sai số cho phép thu đƣợc ở bảng 3.9 đạt yêu cầu, điều này khẳng định sự có mặt của SB, DSB và DDSB và lựa chọn phương pháp LC- MS/MS là phù hợp.
3.3.1.3. Phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn
Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn tại mức nồng độ 5 ng/mL trên các nền mẫu khác nhau. Sắc đồ của các mẫu đƣợc trình bày ở hình 3.10, 3.11, 3.12.
Hình 3.10. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn SB
Hình 3.11. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn DSB
47
Hình 3.12. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn DDSB
Trên sắc đồ mẫu trắng hình 3.10, 3.11 và 3.12 không có tín hiệu của chất phân tích, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn có pic của SB, DSB và DDSB ở thời gian trùng khớp với thời gian lưu của chuẩn tương ứng (chênh lệch thời gian lưu không quá 2%). Như vậy, phương pháp là đặc hiệu để phân tích SB, DSB và DDSB.
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Tiến hành phân tích mẫu trắng thêm chuẩn với nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu chất phân tích. Phân tích lặp lại 6 lần. Tiến hành xác định tỷ lệ S/N tự động theo phần mềm của máy. Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó có S/N = 3.
Giới hạn định lƣợng là giới hạn mà tại đó S/N = 10 hay LOQ = 3,3 LOD. Sắc ký đồ và S/N của SB, DSB, DDSB trên nền mẫu nang mềm đƣợc trình bày ở hình 3.13, 3.14 và 3.15.
Mẫu trắng
48
Hỡnh 3.13. Sắc đồ mẫu trắng thờm chuẩn SB (0,05 àg/kg) trờn nền mẫu nang mềm
Hỡnh 3.14. Sắc đồ mẫu trắng thờm chuẩn DSB (0,1 àg/kg) trờn nền mẫu nang mềm
Hỡnh 3.15. Sắc đồ mẫu trắng thờm chuẩn DDSB (0,1 àg/kg) trên nền mẫu nang mềm
DDSB SB
S/N=3,2
DSB
S/N =3,5
S/N=3,9
49
Qua kết quả thu đƣợc trên sắc đồ ở hình 3.13, 3.14 và 3.15 cho thấy, tại mức hàm lƣợng 0,05 àg/kg, tỷ lệ S/N ≥ 3 đối với SB, do đú LOQ của SB trờn nền viờn nang mềm là 0,15 àg/kg; tại mức hàm lƣợng 0,1 àg/kg, tỷ lệ S/N ≥ 3 đối với DSB và DDSB, vỡ vậy LOQ của DSB và DDSB là 0,3 àg/kg. Khi thờm chuẩn SB, DSB và DDSB trên nền mẫu viên nang cứng và trà túi lọc, nhóm nghiên cứu cũng thu đƣợc kết quả LOD và LOQ giống mẫu viên nang mềm. Với giới hạn định lƣợng thu được, phương pháp có đủ hiệu năng để có thể phân tích các mẫu TPBVSK trên thị trường, đáp ứng được yêu cầu theo quy định tại một số nước Châu âu (EU), Nhật Bản, Hoa Kỳ.
3.3.3. Xây dựng đường chuẩn
Tiến hành xây dựng đường chuẩn 5 điểm có các nồng độ tương ứng 5; 10;
20; 50; 100 ng/mL và phân tích trên LC-MS/MS. Xây dựng đường phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ tương ứng. Đường chuẩn được lập theo phần mềm của thiết bị và đƣợc trình bày ở hình 3.16 đến 3.18.
Hình 3.16. Đường chuẩn SB
y=5,08e+004x+5,35e+003 R2=0,9982
50
Hình 3.17. Đường chuẩn DSB
Hình 3.18. Đường chuẩn DDSB
Khoảng đường chuẩn và độ chệch của các điểm chuẩn của từng chất phân tích đƣợc trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Khoảng đường chuẩn và độ chệch C (ng/g) C tính lại
(ng/g) Bias (%) C tính lại
(ng/g) Bias (%) C tính lại
(ng/g) Bias (%)
5 5,61 12,10 5,54 10,71 4,95 -1,00
10 10,78 7,80 10,28 2,80 10,98 9,81
20 21,20 6,00 21,30 6,50 21,34 6,70
y=6,41e+004x+7,18e+004 R2=0,9998
y=4,93e+004x+6,72e+004 R2=0,9985
51
50 49,70 -0,60 51,91 3,81 51,26 2,52
100 104,52 4,52 98,60 -1,40 98,60 -1,40
SB DSB DDSB
Kết quả trong bảng 3.10 cho thấy, trong khoảng nồng độ từ 5 ng/mL đến 100 ng/mL, nồng độ và diện tích pic của 03 chuẩn DB, DSB và DDSB có mối quan hệ tuyến tính, hệ số tương quan hồi quy (R2 > 0,99), độ chính xác của tất cả các điểm đáp ứng yêu cầu của AOAC, giá trị độ chệch từng điểm chuẩn nằm trong khoảng
±15%. Vì vậy, khoảng nồng độ từ 5 ng/mL đến 100 ng/mL đƣợc nhóm nghiên cứu chọn là khoảng định lƣợng.
3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi
Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích cỏc mẫu trắng thờm chuẩn ở cỏc mức nồng độ khỏc nhau 10; 20; 50 àg/kg, phõn tích lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ. Thêm chuẩn vào 3 nền mẫu viên nang cứng, viên nang mềm và trà túi lọc. Các kết quả độ lặp lại, độ thu hồi đƣợc trình bảy ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Độ lặp lại (RSD%) và độ thu hồi (R%) của SB, DSB và DDSB trên các nền mẫu
Nền mẫu Chất phân tích
10 àg/kg, n = 6 20 àg/kg, n = 6 50 àg/kg, n = 6 R (%) RSD (%) R (%) RSD (%) R (%) RSD (%) Viên nang
cứng
SB 90,6 8,90 99,0 6,42 100,1 6,32
DSB 92,7 7,30 107,3 5,25 101,6 4,98
DDSB 100,1 4,52 84,9 5,01 94,7 3,75
Viên nang mềm
SB 100,4 6,32 100,5 5,85 105,7 5,01
DSB 100,5 10,5 100,5 7,85 107,0 7,01
DDSB 102,6 8,34 104,1 7,56 105,0 4,85
Trà túi lọc
SB 100,5 5,34 109,5 8,72 100,5 6,09
DSB 109,0 4,78 87,7 7,34 93,6 4,01
DDSB 101,8 6,03 108,3 5,85 102,3 4,79
52
Các kết quả trên cho thấy, giá trị độ thu hồi trung bình của SB, DSB và DDSB cả 3 nền mẫu viên nang cứng, viên nang mềm và trà túi lọc lần lƣợt nằm trong khoảng 90,6 – 109,5 %, 92,7 – 109,0% và 84,9 – 108,3%; độ lệch chuẩn tương đối tương ứng từ 5,01 – 8,90 %, 4,01 – 10,5%, 3,75 – 8,34%. Các kết quả này cho thấy phương pháp có độ chính xác đáp ứng yêu cầu của AOAC (độ thu hồi 80- 115% và độ lệch chuẩn tương đối ≤ 15% tại nồng độ 10 àg/kg).