3.1.1. Điều kiện MS/MS
Tiến hành bơm dung dịch chuẩn SB, DSB, DDSB có nồng độ 5 ng/mL vào hệ thống MS. Sau khi chọn chế độ khảo sát tự động để bắn phá ion phân tử mẹ thành các ion con, khảo sát ion mẹ, ion con trên cơ sở tham khảo một số nghiên cứu trước đây [16, 32, 44]. Hai ion con được lựa chọn cho mỗi chất, ion con có cường độ cao hơn được sử dụng để định lượng và ion có cường độ thấp hơn dùng để xác nhận, các kết quả đƣợc trình bày nhƣ trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các điều kiện MS/MS phân tích SB, DSB, DDSB
STT Chất phân tích
Khối lƣợng phân tử
Thời gian lưu
(phút)
Ion mẹ (m/z)
Ion con (m/z)
Thế ion hóa (V)
Năng lƣợng bắn phá (E)
1 SB 278,9
6,37
279,9
124,8 24 26
6,38 138,4 12 26
2 DSB 265,0
6,33
266,0
124,8 22 28
6,34 138,8 16 28
3 DDSB 251,1
6,27
252,1
125,0 47 11
6,28 139,1 47 11
Qua bảng số liệu 3.1. cho thấy, điều kiện khối phổ hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử của SB, DSB và DDSB, số khối của các ion mẹ tương ứng với từng chất phân tích, chúng đều có dạng là [M+H]+, mỗi chất thu đƣợc 2 ion con.
Kết quả này cũng phù hợp với kết quả với một số nghiên cứu trước đây [16, 32, 44].
Để tối ƣu hóa điều kiện MS cho từng chất, nhóm nghiên cứu sử dụng kỹ thuật FIA, hỗn hợp SB, DSB và DDSB cú nồng độ 1àg/mL đƣợc bơm trực tiếp vào khối phổ cùng với dòng pha động mà không qua cột sắc ký với điều kiện nhƣ sau:
32
Kênh A: ACN
Kênh B: Ammoni acetate 2mM + acid formic 0,1%/H2O
Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng ion con định lƣợng và định tính của từng chất. Khảo sát các thông số cho bộ phận tạo nguồn ion, thu đƣợc kết quả các thông số tối ƣu liệt kê trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Các thông số tối ưu của MS để phân tích SB, DSB và DDSB
Thông số Giá trị tối ƣu
IS (V) 5500
TEM (oC) 400
GS1 (psi) 20
GS2 (psi) 20
EP (V) 10
CUR (psi) 25
CAD (psi) 9
3.1.2. Khảo sát điều kiện LC a. Pha tĩnh
Cột tách là bộ phận quan trọng của hệ thống sắc ký. Cột pha đảo C8, C18 đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu xác định SB và chất chuyển hóa của SB [16, 22, 32]. Dựa vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn cột tách là cột pha đảo C18. Trong nghiên cứu này, cột C18 (100mm x 2,1mm, 3,5àm) và tiền cột tương ứng được sử dụng để tỏch SB, DSB và DDSB.
b. Pha động
Pha động ảnh hưởng đến khả năng tách các chất trong hỗn hợp. Tỉ lệ thành phần các dung môi trong pha động sẽ tác động đến khả năng lưu giữ chất phân tích trên cột khác nhau, tốc độ dòng pha động cũng ảnh hưởng tới độ phân giải của hỗn
33
hợp chất phân tích. 5 hệ dung môi được lựa chọn như phần 2.6.1. Chương trình gradient dung môi đƣợc trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Chương trình gradient dung môi phân tích SB, DSB, DDSB
Gradient
Thời gian (phút)
Thành phần pha động
% ACN
% MeOH
Ammoni acetate
2mM
Ammoni formate
2mM
Ammoni formate
2mM+
acid formic
0,1%
Ammoni acetate 2mM+
acid formic
0,1%
Gradient 1
0,00 90 - 10 - - -
2,00 90 - 10 - - -
5,00 10 - 90 - - -
8,00 90 - 10 - - -
Gradient 2
0,00 - 90 10 - - -
2,00 - 90 10 - - -
5,00 - 10 90 - - -
8,00 - 90 10 - - -
Gradient 3
0,00 90 - - 10 - -
2,00 90 - - 10 - -
5,00 10 - - 90 - -
8,00 90 - - 10 - -
Gradient 4
0,00 90 - - - 10 -
2,00 90 - - - 10 -
5,00 10 - - - 90 -
8,00 90 - - - 10 -
Gradient 5
0,00 90 - - - - 10
2,00 90 - - - - 10
5,00 10 - - - - 90
8,00 90 - - - - 10
Thêm chuẩn vào nền mẫu và tiến hành phân tích trên hệ thống LC-MS/MS với 05 hệ pha động đã lựa chọn. Các thông tin của tín hiệu píc thu đƣợc của SB, DSB và DDSB thu đƣợc trong bảng 3.4.
34
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pha động đến diện tích píc các chất phân tích
Pha động
Sibutramine N-desmethyl sibutramine
N-didesmethyl sibutramine Diện tích
píc
RT (phút)(*)
Diện tích
pic RT (*) Diện tích pic RT (*) Hệ pha
động 1 5,17 x 105 6,50 6,94 x 105 6,39 4,21 x 105 6,35 Hệ pha
động 2 5,01 x 105 8,55 6,54 x 105 6,65 3,89 x 105 6,67 Hệ pha
động 3 8,25 x 105 6,45 9,01 x 105 6,40 4,72 x 105 6,34 Hệ pha
động 4 6,29 x 105 7,11 6,78 x 105 7,16 3,11 x 105 7,18 Hệ pha
động 5 9,09 x 105 6,29 1,25 x 105 6,27 9,61 x 105 6,23 RT (*): Thời gian lưu
Kết quả trong bảng 3.4 cho thấy hệ pha động 5 cho diện tích píc của SB, DSB và DDSB lớn nhất, do đó hệ pha động 5 đƣợc chọn để tiến hành tách và định lƣợng SB, DSB và DDSB. Để tối ƣu hóa quá trình tách và định lƣợng SB và dẫn xuất của SB, tỉ lệ thành phần của pha động 5 tiếp tục đƣợc thay đổi để khảo sát. Sau khảo sát, chương trình dung môi được chọn như bảng 3.5 để định lượng SB và dẫn xuất.
Bảng 3.5. Chương trình dung môi tối ưu Thời gian / (phút) %A
(ACN)
%B
(Ammoni acetate 2mM+ acid formic 0,1% )
0,01 100 0
3,00 90 10
5,00 5 95
7,00 5 95
35 Thời gian / (phút) %A
(ACN)
%B
(Ammoni acetate 2mM+ acid formic 0,1% )
8,00 90 10
10,0 90 10
Áp dụng chương trình dung môi như bảng 3.5 và tốc độ dòng 0,4 mL/ phút, píc của SB, DSB và DDSB thu đƣợc nhƣ hình 3.1.
Hình 3.1. Sắc ký đồ của SB (3.1a), DSB (3.1b) và DDSB (3.1c) sau khi tối ưu hóa chương trình dung môi pha động
Qua khảo sát tín hiệu (bảng 3.4) và hình dạng píc (hình 3.1) của SB, DSB và DSB, tín hiệu píc của 03 chất phân tích thu đƣợc thu đƣợc là lớn nhất, khả năng tách chất phân tích tốt nên thành phần pha động đƣợc lựa chọn để ứng dụng phân tích mẫu là hệ pha động 5 với thành phần nhƣ sau:
Kênh A: ACN
Kênh B: Ammoni acetate 2mM + acid formic 0,1%/H2O