CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6. Phương pháp nghiên cứu
2.6.1. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)
Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ đƣợc sử dụng là hệ thống khối phổ 5500QQQ ghép nối với hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao LC20AD của Shimadzu đƣợc thể hiện trong hình 2.1, đây là thiết bị có độ nhạy cao, phù hợp với đối tƣợng mẫu phân tích là mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nền mẫu phức tạp. Do đó, nhóm nghiên cứu đã chọn để định lƣợng SB, DSB và DDSB.
26
Hình 2.1. Thiết bị LC-MS/MS 5500QQQ được lựa chọn sử dụng
* Điều kiện LC
Cột sắc ký C18 (100mm x 2,1mm, 3,5àm) và tiền cột tương ứng của hóng Waters, Mỹ đƣợc lựa chọn trong đề tài này. Loại dung môi, tỉ lệ các thành phần dung môi, tốc độ rửa giải của pha động ảnh hưởng đến hiệu quả tách các chất. Đây là lí do cần phải khảo sát thành phần hệ pha động, tốc độ rửa giải trong quá trình phân tích SB, DSB và DDSB. Dựa trên một số tham khảo [9, 10, 16, 20, 32] và các dung môi, hóa chất của phòng thí nghiệm, 05 hệ pha động đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu bao gồm:
Hệ pha động 1: kênh A: ACN, kênh B: ammoni acetate 2mM;
Hệ pha động 2: kênh A: MeOH, kênh B: ammoni acetate 2mM;
Hệ pha động 3: kênh A: ACN, kênh B: ammoni formate 2mM;
Hệ pha động 4: kênh A: ACN, kênh B: ammoni formate 2mM+ acid formic 0,1%;
Hệ pha động 5: kênh A: ACN, kênh B: ammoni acetate 2mM + acid formic 0,1%/H2O.
* Điều kiện MS
Sau khi đƣợc phân tách bởi hệ thống LC, chất phân tích sẽ đƣợc hóa hơi tạo thành các ion. Các ion đƣợc chuyển đến lối vào của hệ thống phân tích khối phổ MS loại dung môi chuyển vào bộ phận MS của máy khối phổ thông qua bộ phận ghép nối LC-MS.
27
Điều kiện phân mảnh, điều kiện của nguồn và khí đƣợc tự động tối ƣu trên hệ thống MS. Bơm trực tiếp dung dịch mỗi chuẩn đơn vào đầu dò khối phổ với chế độ ion dương (ESI+), chế dộ ghi phổ MRM. Lựa chọn 1 ion mẹ và 2 ion con đối với mỗi chất phân tích, ion có cường độ cao hơn được sử dụng để định lượng, ion có cường độ thấp hơn sử dụng để khẳng định.
2.6.2. Phương pháp xử lý mẫu
* Chuẩn bị mẫu sơ bộ
Mẫu dạng viên nang cứng: lấy khoảng 20 viên, bỏ vỏ, xay trộn đều
Mẫu dạng viên nang mềm: lấy khoảng 20 viên, bỏ vỏ, xay trộn đều
Mẫu dạng trà túi lọc: lấy 20 túi lọc, bỏ túi, xay trộn đều khoảng 20 – 50 g
* Quy trình chiết
Khảo sát dung môi chiết
Để chọn đƣợc dung môi chiết mẫu thích hợp, mẫu đƣợc chiết bằng 04 loại dung môi khác nhau: MeOH, ACN, EtOH, Acetone (nhƣ phần 2.2.2). Mẫu thêm chuẩn đƣợc chiết bằng 4 dung môi, dung môi đƣợc lựa chọn là dung môi cho độ thu hồi mẫu thêm chuẩn cao hơn. Mẫu thêm chuẩn là mẫu có nền là TPBVSK hỗ trợ giảm cân không chứa chất phân tích, sau đó đƣợc thêm các chuẩn SB, DSB và DDSB.
Khảo sát thời gian chiết
Sau khi chọn đƣợc dung môi chiết phù hợp, tiến hành khảo sát thời gian chiết mẫu. Cân mẫu, thêm dung môi, rung, siêu âm và chiết trong 10 phút, 30 phút, 60 phút. So sánh hiệu suất thu hồi của chất phân tích để chọn thời gian chiết thích hợp.
Khảo sát số lần chiết
Chất phân tích tan trong dung môi chiết, để chiết đƣợc tối đa chất phân tích khỏi nền mẫu, thông thường sẽ chiết nhiều lần. Chất phân tích được tiến hành chiết 1 lần, 2 lần, 3 lần trên cả 3 nền mẫu: viên nang cứng, viên nang mềm và trà túi lọc. Đánh giá hiệu suất thu hồi để chọn lựa số lần chiết phù hợp.
Khảo sát quy trình làm sạch mẫu
Sau khi lựa chọn được dung môi chiết, do mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe thường có chứa các tạp màu, để loại tạp và tăng tuổi thọ cho thiết bị LC-MS/MS, nhóm
28
nghiên cứu tiến hành khảo sát 4 quy trình làm sạch mẫu khác nhau. Mẫu sau khi chiết và định mức, sẽ đƣợc tiến hành làm sạch theo các qui trình nhƣ trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Quy trình làm sạch mẫu Quy trình 1
Không có giai đoạn làm sạch
Quy trình 2 Làm sạch qua cột
SPE SCX
Quy trình 3 Làm sạch qua cột
SPE HLB (mẫu đƣợc hòa tan trong
dung dịch acid H3PO4)
Quy trình 4 Làm sạch bằng kỹ thuật d-SPE sử dụng các bon hoạt tính (mẫu
sau khi chiết bằng MeOH, thêm 4,0 gam MgSO4, 1,5 gam NaCl
lắc mạnh 1 phút, rung siêu âm 30 phút và
định mức) Lọc mẫu qua
giấy lọc và màng lọc 0,22 àm
- Hoạt hóa cột: 6 mL MeOH, 6 mL H2O.
- Nạp mẫu: 4 mL - Rửa tạp bằng 3 mL H2O, 3 mL MeOH.
- Rửa giải: 4 mL MeOH : NH4OH (95:5, v/v)
- Hoạt hóa cột: 3 mL MeOH, 3 mL H2O.
- Nạp mẫu: 4 mL - Rửa tạp: 3 mL H2O - Rửa giải: 3 mL MeOH
- Hút 10 mL dịch chiết vào ống d-SPE có chứa sẵn 25 mg GCB.
- Lắc khoảng 30 giây – 1 phút.
- Ly tâm khoảng 1 phút, hút ra vial (không để lâu trong ống chứa bột làm sạch, tránh ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi).
Mẫu sau khi đƣợc làm sạch ở các điều kiện khác nhau sẽ đƣợc tiến hành phân tích trên thiết bị LC-MS/MS. Đánh giá độ thu hồi của mẫu thêm chuẩn theo 4 quy trình trên là căn cứ để chọn lựa quy trình làm sạch mẫu tối ƣu.
29 2.6.3. Phương pháp thẩm định
2.6.3.1. Tính chọn lọc
Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá bằng cách so sánh phổ của mẫu chuẩn SB, DSB, DDSB trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng không đƣợc lên tín hiệu của chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn.
Ngoài ra, tính chọn lọc còn đƣợc khẳng định bằng số điểm nhận dạng IP, yêu cầu có tối thiểu 4 điểm IP và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC657/20002 của Châu Âu.
2.6.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
LOD, LOQ đƣợc xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích.
Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio) [1].
Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền LOD đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu đường nền (S/N = 3).
LOQ đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đường nền (S/N = 10).
2.6.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ chất phân tích.
Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích, tại đó được chứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính.
Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi từ 5 đến 100 ng/mL và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu được và nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính.
Sau khi xác định đƣợc khoảng tuyến tính của các chất, chúng tôi đã xây dựng đường chuẩn. Đường chuẩn xây dựng được có hệ số tương quan R nằm trong khoảng từ 0,995 đến 1. Sử dụng đường chuẩn để định lượng SB, DSB và DDSB.
30 2.6.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi
Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau là 10, 20 và 50 àg/kg (n = 6), tớnh toỏn kết quả theo cỏc cụng thức sau:
Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) biểu diễn bởi công thức (1).
RSD(%) = Trong đó:
xi : Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ ―i‖
: Nồng độ trung bình tính đƣợc của N lần thử nghiệm.
n : Số lần thử nghiệm.
Độ thu hồi biểu diễn bởi công thức (2) R(%) = C
Cc .100 Trong đó:
R: độ thu hồi (%)
C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn.
Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết).
2.6.4. Phương pháp lấy mẫu
Lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên
Lƣợng mẫu lấy phù hợp với thông tƣ 14/2011/TT-BYT.
Địa điểm lấy mẫu: Các cửa hàng thuốc tại Hà Nội.
2.6.5. Phương pháp xử lý số liệu
Tính hàm lƣợng sibutramine, desmethyl sibutramine và didesmethyl sibutramine trong mẫu bằng phần mềm của thiết bị LC-MS/MS (Analyst 1.5). Các kết quả thẩm định phương pháp được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.
100 x. S
1
1
2
N x x S
N
i i
x
(1)
(2)
31