3.2. Khảo sát quá trình chuẩn bị mẫu
3.2.3. Khảo sát quy trình làm sạch mẫu
Để loại tạp cho dung dịch sau chiết, trước khi tiến hành xác định hàm lượng các chất trên thiết bị LC-MS/MS, 4 quy trình làm sạch mẫu đƣợc khảo sát gồm:
Quy trình 1: chiết mẫu, lọc mẫu, và tiến hành xác định ngay bằng thiết bị LC- MS/MS.
Quy trình 2: Loại tạp bằng cách cho mẫu chiết qua cột SPE-SCX Quy trình 3: Loại tạp bằng cách cho mẫu chiết qua cột SPE-HLB Quy trình 4: Sử dụng than hoạt tính
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
SB DSB DDSB
Hiệu suất thu hồi (%)
Chiết 1 lần Chiết 2 lần Chiết 3 lần
41
Kết quả hiệu suất thu hồi các chất phân tích tương ứng với từng quy trình làm sạch mẫu đƣợc trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi SB, DSB và DSB sau khi làm sạch
Quy trình làm sạch
Viên nang cứng Viên nang mềm Trà túi lọc
SB DSB DDSB SB DSB DDSB SB DSB DDSB
Quy trình 1 90,7 93,7 85,0 91,3 82,7 89,0 93,1 92,7 83,1 Quy trình 2 93,9 98,7 91,5 96,2 89,7 99,2 95,6 81,7 95,1 Quy trình 3 37,3 25,8 18,5 27,3 18,8 23,5 31,3 12,8 19,9 Quy trình 4 94,8 107,0 100,0 85,2 92,3 98,0 95,8 108,0 91,0 Từ kết quả bảng 3.7 cho thấy, áp dụng quy trình 1, quy trình 2 và quy trình 4 đểu cho kết quả hiệu suất thu hồi tốt. Nhƣ vậy có thể sử dụng một trong ba quy trình đó để làm sạch mẫu, tuy nhiên với quy trình 1, nếu chỉ hòa tan mẫu trong dung môi và lọc mẫu qua màng lọc và bơm thẳng mẫu vào trong thiết bị phân tích, khi số lƣợng mẫu phân tích nhiều, tuổi thọ của cột sắc ký sẽ giảm. Đối với quy trình 2, xét về mặt hiệu suất thu hồi cũng có thể áp dụng để làm sạch mẫu, tuy nhiên quy trình có nhiều công đoạn, và giá thành cột cao hơn khi áp dụng quy trình 4. Quy trình 3 sử dụng cột HLB, các chất phân tích bị mất nhiều khi đi qua cột, chúng không đƣợc lưu lại trên cột, do đó độ thu hồi thấp. Nguyên tắc của quy trình 3 là cho mẫu hòa tan trong môi trường acid H3PO4, chất phân tích là kiềm yếu, chúng sẽ kết hợp với nhau tạo thành muối. HLB là một copolymer của m-divinylbenzene và n- vinylpyrrolidon, kỵ nước nhưng lại có khả năng lưu giữ chất ưa nước hay chất phân cực. Sau khi chất phân tích được lưu giữ trên cột, NH4OH được lựa chọn là dung môi rửa tạp, ACN là dung môi rửa giải chất phân tích [18, 22]. Theo kết quả trong nghiên cứu của Tarita và đồng nghiệp khi xây dựng phương pháp nhận dạng SB.
HCl trong thuốc truyền thống sử dụng chiết pha rắn HLB, hiệu suất thu hồi SB.
HLB nằm trong khoảng 38 – 45% [18]. Kết quả trong bảng 3.7 mà nhóm thực hiện đề tài đã thu được cũng có kết quả thấp tương tự. Qua những phân tích về hiệu suất
42
thu hồi và hiệu quả kinh tế, nhóm nghiên cứu chọn quy trình 4, sử dụng các bon hoạt tính để loại tạp cho mẫu.
3.2.4. Khảo sát khối lượng than hoạt tính
Do lượng than hoạt tính ảnh hưởng tới khả năng hấp phụ các chất phân tích, đây có thể là nguyên nhân ảnh hưởng đến độ thu hồi của chất phân tích. Sau khi lựa chọn than hoạt tính để làm sạch mẫu, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát khối lượng than hoạt tính tương đồng với lượng mẫu cần làm sạch. Sau khi làm sạch mẫu bằng than hoạt tính, dung dịch mẫu thu đƣợc trong hơn hình 3.8 cho thấy sự khác biệt khi sử dụng than hoạt tính để làm sạch mẫu.
Hình 3.8. Dung dịch mẫu trước và sau khi sử dụng làm sạch bằng GCB Cân các lƣợng than hoạt tính khác nhau: 10 mg, 25 mg, 50 mg và 75 mg vào ống ly tâm. Hút chính xác 10mL mẫu sau khi chiết lần lƣợt vào ống ly tâm đã chứa sẵn than hoạt, mỗi khối lƣợng làm lặp 6 lần. Lắc và ly tâm trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút. Lọc phần dịch trong vào vial, tiến hành phân tích trên thiết bị LC-MS/MS, xử lý kết quả và đánh giá hiệu suất thu hồi. Kết quả thu đƣợc đƣợc trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng lượng GCB đến hiệu suất thu hồi SB, DSB, DDSB Khối lƣợng than
hoạt tính (mg)
Hiệu suất thu hồi (%)
SB DSB DDSB
10 79,8 62,7 68,5
25 82,5 101,3 98,5
43 Khối lƣợng than
hoạt tính (mg)
Hiệu suất thu hồi (%)
SB DSB DDSB
50 78,3 82,8 65,3
75 76,5 63,4 62,1
Kết quả bảng 3.8 cho thấy hiệu suất thu hồi của chất phân tích phụ thuộc vào hàm lƣợng than hoạt tính, khi hàm lƣợng than hoạt tính là 10 mg, hiệu suất thu hồi thấp, điều này có thể đƣợc giải thích là do lƣợng than hoạt không đủ để hấp phụ tạp màu trong nền mẫu, tuy nhiên, lƣợng than hoạt tính là 50 mg, 75 mg thì hiệu suất thu hồi bị giảm, nguyên nhân có thể do than hoạt tính đã hấp phụ chất phân tích.
Nhƣ vậy, với các số liệu thu nhận đƣợc, lƣợng than hoạt tính 25mg cho kết quả hiệu suất thu hồi SB, DSB và DDSB là tốt nhất, do đó nhóm nghiên cứu lựa chọn hàm lƣợng than hoạt là 10 mg để làm sạch 10 mL mẫu.
Sau khi khảo sát và lựa chọn đƣợc các điều kiện chiết, tách, làm sạch mẫu phù hợp, quy trình tối ƣu phân tích SB, DSB và DDSB trong mẫu TPBVSK hỗ trợ giảm cân đƣợc trình bày ở hình 3.9.
44
Hình 3.9. Quy trình tối ưu xác định SB, DSB và DDSB trong mẫu