CHƯƠNG 2. MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm
2.4.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus plantarum
2.4.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa
❖ Quy trình thí nghiệm:
Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hoá chủng Lactobacillus plantarum
❖ Thuyết minh quy trình:
Mục đích: Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loài vi sinh vật khác trong quá trình bảo quản. Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng.
Ủ 24-48h Chủng vi khuẩn LAB
Tăng sinh trong môi trường MRS-broth
Cấy truyền sang môi trường MRS agar
Quan sát hình thái khuẩn lạc
Khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa
- Nhuộm Gram - Nhuộm bào tử - Catalase
Chủng LAB thuần khiết
39 Tiến hành:
❖ Khảo sát đặc điểm nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc:
Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và C1 được hoạt hoá và tăng sinh trong môi trường MRS broth đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 15 phút và ủ ở 37℃ trong 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển sang môi trường MRS agar để ủ ở 37℃ trong 48 giờ, sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc lactic.
Tiếp theo, tiến hành khảo sát lại các đặc điểm nuôi cấy của chủng vi khuẩn lactic bao gồm các phương pháp: nhuộm gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalase.
• Môi trường giữ giống:
Sau khi đã khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng, tiến hành cấy chuyển khuẩn lạc sang môi trường MRS agar trong ống thạch nghiêng, ủ ở 37℃ trong 24 đến 48 giờ và bảo quản trong tủ lạnh phòng thí nghiệm.
❖ Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá
➢ Nhuộm Gram Tiến hành:
Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến
− Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
− Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần.
− Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
− Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
− Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước, thấm khô.
− Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 30 giây, rửa nước, để khô trong không khí.
− Soi kính: dùng vật kính dầu 100x.
40
Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ.
➢ Nhuộm bào tử
Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton
− Nuôi cấy vi khuẩn ở 37oC, 5 - 7 ngày.
− Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram.
− Nhuộm bằng dung dịch malachite green trong 10 phút, rửa nước.
− Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.
− Soi kính: dùng vật kính dầu 100x.
Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ.
➢ Thử nghiệm catalase Tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3 - 10%, nhỏ một giọt lên phiến kính.
Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính.
Kết quả: Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính.
Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết quả tương tự.
41 2.4.1.2 Khả năng sinh acid
❖ Quy trình thí nghiệm:
Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh acid chủng Lactobacillus plantarum
❖ Thuyết minh quy trình:
Mục đích: Xác định khả năng sinh acid của chủng Lactobacillus plantarum Tiến hành:
− Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và C1 được hoạt hoá và tăng sinh trong môi trường MRS broth đã được hấp khử trùng ở 121℃
trong 15 phút và ủ ở 37℃ trong 24 giờ.
− Hút 10 ml dịch tăng sinh vào ống Falcon (lặp lại 3 lần). Ly tâm 4000 vòng / 15 phút, phần dịch sau ly tâm cho vào erlen.
Ủ 370C 24h Chủng vi
khuẩn LAB
Tăng sinh trong môi trường MRS - broth
Ly tâm
Dịch sau ly tâm
Acid tổng (%TA) Chuẩn độ NaOH
0,1N Phenolphthalein
Sinh khối
42
− Bổ sung 3 giọt phenolphthalein, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi dung dịch có màu hồng nhạt và pH = 8 – 8,3.
Kết quả:
%𝑇𝐴 =
𝑠ố 𝑚𝑙 𝑁𝑎𝑂𝐻 × 0.1𝑁 × 90 × 100 𝑡ℎể 𝑡í𝑐ℎ 𝑚ẫ𝑢
1000
Trong đó:
- %TA: độ acid
- Số ml NaOH: thể tích NaOH 0,1N đã sử dụng đổ chuẩn độ.
- Thể tích mẫu (ml): dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus plantarum Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4
43
2.4.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus plantarum in vitro
❖ Quy trình thí nghiệm:
Hình 2.5: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn.
Đặt thạch nấm Đặt thạch nấm
Hoạt hóa chủng vi khuẩn LAB trên môi trường
MRS - broth
Tăng sinh chủng vi khuẩn LAB trên môi trường
MRS - broth
Tăng sinh A.Niger trên môi trường PDB
Cấy vào đĩa petri chứa môi trường PDA
Đo đường kính ức chế nấm
Tỷ lệ ức chế nấm bệnh Ủ 72h ở nhiệt độ phòng
Hoạt hóa A.Niger trên môi trường PDB
ĐC âm (Không ria vi khuẩn)
Ria 2 đường
LAB
44
❖ Thuyết minh quy trình:
Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của chủng vi khuẩn theo phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn.
Tiến hành:
• Chuẩn bị môi trường vi khuẩn:
Hoạt hóa 2 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm: hoạt hóa trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h.
• Chuẩn bị chủng nấm để đối kháng:
Hoạt hóa chủng nấm mốc có sẵn trong phòng thí nghiệm: hoạt hóa trong môi trường PDB ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường PDB ở 370C trong 24h.
Cấy điểm vào đĩa petri chứa môi trường PDA và ủ 72h ở nhiệt độ phòng.
• Chuẩn bị môi trường khảo sát đối kháng:
Môi trường MRS cải tiến được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó, phối vào đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa 15 ml.
Khi thạch đã đông, ta tiến hành đục thạch ở đĩa nấm mốc đặt vào tâm các đĩa.
Mỗi đĩa lặp lại 3 lần. Sau đó, ủ 24h ở nhiệt độ phòng.
Sau 24h, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn cách ngoài mép đĩa 1,5 cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm đĩa trên cùng một đường kính) cần thử đối kháng vào. Mẫu đối chứng là chỉ cấy nấm vào tâm đĩa, không cấy 2 vạch vi khuẩn lên. Tiếp tục ủ 72h ở nhiệt độ phòng.
Quan sát, đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm sau 3 ngày.
Ta tiến hành đo tỉ lệ ức chế theo hình và công thức phần trăm: