PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.4. Phương pháp nghiên cứu
3.2.4.1. Nghiên cứu, phân tích hiện trạng nuôi, dịch bệnh (gan thận mủ, xuất huyết) trên cá tra tại hai tỉnh An Giang và Bến Tre từ năm 2014 - 2016
- Để đánh giá đặc điểm tình hình nuôi và dịch bệnh trên cá tra, các số liệu về diện tích nuôi và số liệu về dịch bệnh trên cá tra được thu thập từ cấp xã, huyện và tỉnh của các tỉnh Bến Tre bằng biểu mẫu do Cục Thú y ban hành (Công văn số 1245/TY-TS ngày 24/6/2016 và Công văn số 113/TY-TS ngày 20/01/2017).
- Các phương pháp dịch tễ học mô tả được sử dụng để tổng hợp, phân tích và đánh giá tình hình nuôi và tình hình dịch bệnh trên cá tra.
3.2.4.2. Đánh giá một số đặc điểm dịch tễ của bệnh gan thận mủ và bệnh xuất huyết trên cá tra tại Bến Tre và An Giang; đánh giá các yếu tố nguy cơ liên quan đến sự lưu hành các bệnh trên cá tra tại Bến Tre và An Giang
Đề nghiên cứu xác định mức độ lưu hành và đánh giá các yếu tố nguy cơ có liên quan đến lưu hành bệnh gan thận mủ và bệnh xuất huyết trên cá tra, chúng tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu cắt ngang (cross-sectional study) để tiến hành tại các cơ sở sản xuất, nuôi cá tra trên địa bàn hai tỉnh An Giang và Bến Tre, cụ thể như sau:
* Phương pháp chọn mẫu cơ sở:
Phương pháp lấy mẫu nhiều giai đoạn (multistage sampling) được áp dụng như sau:
- Giai đoạn 1: Tại mỗi tỉnh, lựa chọn có chủ đích 02 huyện dựa trên những tiêu chí (1) Là vùng trọng điểm về nuôi cá tra; (2) Thường xuyên xuất hiện dịch bệnh. Cụ thể:
+ Tỉnh Bến Tre: Chọn có chủ đích huyện Chợ Lách và huyện Châu Thành;
+ Tỉnh An Giang: Chọn có chủ đích huyện Châu Phú và huyện Phú Tân.
- Giai đoạn 2: Tại mỗi huyện, lựa chọn ngẫu nhiên 15 cơ sở nuôi cá tra thương phẩm nuôi theo hình thức thâm canh, bán thâm canh phục vụ xuất khẩu và 05 cơ sở sản xuất cá tra giống, cụ thể:
+ Tỉnh Bến Tre: Tổng số cơ sở sản xuất cá tra giống và cá tra nuôi thương phẩm của 2 huyện được lựa chọn để làm giám sát là 35 cơ sở (bao gồm 01 cơ sở sản xuất giống và 34 cơ sở nuôi cá tra thương phẩm), do đó toàn bộ 35 cơ sở này đã được lựa chọn để lấy mẫu.
+ Tỉnh An Giang: Mỗi huyện lựa chọn ngẫu nhiên 15 cơ sở nuôi cá tra thâm canh, bán thâm canh phục vụ xuất khẩu và 05 cơ sở sản xuất giống.
Kết quả thực tế, tại 2 tỉnh đã lựa chọn ngẫu nhiên được 76 cơ sở (bao gồm 64 cơ sở nuôi cá tra thương phẩm và 11 cơ sở sản xuất cá tra giống).
Số lượng cơ sở tại mỗi tỉnh cần giám sát được tính theo công thức:
2 2
1
1 z e
n
Trong đó:
- P: Là giá trị lưu hành ước tính ở cấp độ cơ sở là 10%;
- e: Là sai số tuyệt đối (giữa giá trị ước tính và giá trị thực) là 10%;
- z: Chỉ số thể hiện khoảng tin cậy 95% (z = 1,96).
- Giai đoạn 3: Tại mỗi cơ sở giám sát, lựa chọn ngẫu nhiên 02 ao nuôi cá để lấy mẫu. Các ao này có thể khác nhau ở các lần lấy mẫu, nhưng phải bảo đảm các ao thuộc cơ sở đã được lựa chọn. Trong trường hợp cơ sở chỉ có 01 ao thì chọn thêm 01 ao của hộ liền kề để lấy mẫu. Trong quá trình giám sát, nếu cơ sở không tiếp tục nuôi hoặc không tiếp tục tham gia thì chọn cơ sở thay thế trên cùng vùng nuôi đó.
* Triển khai giám sát bị động:
- Hướng dẫn các cở sở sản xuất giống, nuôi cá tra lập sổ theo dõi hàng ngày về tình hình sản xuất và dịch bệnh.
- Hướng dẫn chủ cơ sở nuôi cá tra báo cáo cho Trạm Thú y và lấy mẫu gửi về phòng xét nghiệm của Cơ quan Thú y vùng VI (đối với tỉnh Bến Tre) và Cơ quan Thú y vùng VII (đối với tỉnh An Giang) khi có nghi ngờ xuất hiện bệnh.
* Triển khai giám sát chủ động và lấy mẫu như sau:
- Mẫu nước, bùn trong ao nuôi: Lấy 05 mẫu nước và 05 mẫu bùn ở tầng đáy tại 05 vị trí khác nhau trong ao (mỗi vị trí lấy 100 ml). Sau đó, 05 mẫu nước được trộn thành 01 mẫu và 05 mẫu bùn được trộn thành 01 mẫu.
- Mẫu thức ăn tươi sống: Tại các cơ sở sản xuất cá tra giống lấy 02 mẫu thức ăn tươi sống.
Tất cả các loại mẫu cần được bảo quản lạnh để vận chuyển về phòng thí nghiệm của Cơ quan Thú y vùng VI (đối với tỉnh Bến Tre) và Cơ quan Thú y vùng VII (đối với tỉnh An Giang) để xét nghiệm. Tại phòng thí nghiệm, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 4 - 8 oC, xét nghiệm phát hiện tác nhân gây bệnh gan thận mủ bằng phương pháp Real-time PCR và bệnh xuất huyết bằng phương pháp nuôi cấy, định danh vi khuẩn.
- Mẫu cá tra: Tại mỗi cơ sở sản xuất cá tra giống hoặc cơ sở nuôi cá tra thương phẩm lấy số lượng cá như Bảng 3.1 để xét nghiệm (Phụ lục 3).
Bảng 3.1. Số lượng cá thu/mẫu để xét nghiệm bệnh.
TT Thời gian sau khi thả cá (tháng)
Số lượng cá tra (con/ao)
Số lượng mẫu gộp xét nghiệm (mẫu/ao)
1 ≤ 2 05 1
2 2 - 4 04 1
3 ≥ 4 03 1
Ghi chú: Mẫu cá có thể lấy nguyên con hoặc nếu cá trên 4 tháng chỉ cần lấy gan, thận, lách bảo quản theo quy định rồi vận chuyển về phòng xét nghiệm.
- Lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu giám sát: Thực hiện theo QCVN 01-83:2011/BNNPTNT ban hành kèm theo Thông tư số 71/2011/TT-BNNPTNT ngày 25/10/2011 của Bộ NN&PTNT.
- Tần suất lấy mẫu: Lấy mẫu tại các cơ sở sản xuất cá tra giống và nuôi cá tra thương phẩm với tần suất 2 tuần/lần; lấy liên tục trong vòng 05 tháng, kể từ tháng 03/2016.
- Kiểm tra các chỉ số môi trường nước ao nuôi giám sát: Định kỳ 1 ngày/lần, chủ cơ sở sản xuất, nuôi cá tra đo các chỉ số về nhiệt độ, pH và ôxy hòa tan.
* Xét nghiệm mẫu:
- Xét nghiệm phát hiện tác nhân gây bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E.
ictaluri bằng phương pháp Real-time PCR.
- Xét nghiệm phát hiện tác nhân gây bệnh xuất huyết do vi khuẩn A.
hydrophila bằng phương pháp phân lập định danh (sơ đồ xét nghiệm, phân lập - Phụ lục 4).
* Thu thập thông tin về các yếu tố nguy cơ
Mỗi lần lấy mẫu đều phải thu thập (điều tra) thông tin theo phiếu điều tra (Phụ lục 1, 2), kể cả trong trường hợp thông tin giống nhau giữa các lần lấy mẫu.
Một số hình ảnh thu được trong quá trình thực hiện đề tài được thể hiện ở Phụ lục 3.
* Quản lý và phân tích số liệu:
- Kết quả xét nghiệm và dữ liệu thu từ thực địa được nhập vào file MS.
Excel 2010.
- Phân tích mô tả tình hình nuôi cá tra, dịch tễ học mô tả (theo không gian, thời gian và theo đối tượng) theo các phương pháp dịch tễ, thống kê thường quy.
- Tỷ lệ các cơ sở nuôi cá tra bị bệnh được tính theo phương pháp của Fleiss (Fleiss, 1981). So sánh tỷ lệ các cơ sở bị bệnh được phân tích, dựa vào chỉ số Chi-square.
- Phân tích đa tầng nhiều biến (multilevel analysis) được áp dụng để định lượng các yếu tố nguy cơ theo các phân tầng khác nhau (Dohoo et al., 2001;
Dohoo, 2003; Long, 2013), cụ thể theo các bước sau:
+ Bước 1: Xác định “Đầu ra” là cơ sở có cá tra bị bệnh xuất huyết hoặc gan thận mủ.
+ Bước 2: Phân tích sàng lọc (bivarriate analyses) để xác định mối liên hệ giữa “Đầu ra” và từng yếu tố nguy cơ. Phương pháp kiểm tra của Wald (Agresti, 2007) được sử dụng để xác định mối liên hệ giữa các biến nguy cơ với “Đầu ra”.
Tất cả các biến nguy cơ có mối liên hệ với “Đầu ra” về mặt thống kê, sinh học và có giá trị P < 0,2 được giữ lại để đưa vào phân tích đa biến (Bước 3). Những biến nguy cơ có mối liên hệ với với “Đầu ra” ở giá trị P > 0,2 thì được loại bỏ, theo nguyên tắc, loại bỏ các biến có giá trị P cao nhất cho đến khi chỉ còn các biến có P < 0,2.
+ Bước 3: Phân tích đa biến (multivariable analyses): Tất cả các biến có P
< 0,2 được xác định tại Bước 2 được đưa vào mô hình đa biến và chạy mô hình phân tích. Chỉ những biến nguy cơ nào có mối liên hệ về mặt thống kê, sinh học với “Đầu ra” và có giá trị P < 0,05 thì giữ lại để tính ảnh hưởng của các biến đa cấp tại Bước 4.
+ Bước 4: Các yếu tố ảnh hưởng ngẫu nhiên cũng được đưa vào mô hình hồi quy logic hỗn hợp (mixed-effects logistic regression model) để phân tích và đánh giá mức độ ảnh hưởng không thể đo được của các yếu tố ở cấp cơ sở nuôi cá tra, cấp xã và cấp tỉnh lên khả năng một cơ sở nuôi cá tra bị bệnh xuất huyết, gan thận mủ. Dựa trên cách tiếp cận này, chuyển dạng logic (logit transform) cơ sở bị bệnh i ở xã j tại tỉnh k, pijk, được mô hình hóa theo chức năng tuyến tính của một loạt các yếu tố ảnh hưởng m là β1… βm và ảnh hưởng của các yếu tố nguy cơ ở các cấp độ cơ sở nuôi nuôi, cấp xã Xj và tỉnh Pk được tính theo công thức sau:
ijk k j mijk m
i m ijk
ijk x X P
p
p
1
1 0
log
Kết quả của mô hình cuối cùng được thể hiện bởi tỷ số chênh đã được điều chỉnh cho mỗi biến nguy cơ. Tỷ số chênh (odds ratio, OR) lớn hơn 1 cho thấy cơ sở nuôi cá tra khi phơi nhiễm với yếu tố nguy cơ có khả năng bị bệnh tăng lên. Ngược lại, nếu OR < 1 cho thấy nguy cơ sở nuôi cá tra bị bệnh giảm đi.
OR = 1 cho thấy không có ảnh hưởng của các yếu tố lên nguy cơ các cơ sở nuôi bị bệnh.
Đường cong đặc trưng thể hiện hoạt động của bộ thu nhận (Receiver Operating Characteristic, ROC) được vẽ để biểu thị khả năng dự đoán của mô hình logic. Vùng dưới đường cong ROC có giá trị dao động từ 0 - 1 để mô tả khả năng dự đoán của mô hình đối với một cơ sở bị bệnh hoặc không bị bệnh. Giá trị dưới đường cong ROC càng lớn, cho thấy khả năng mô hình phỏng đoán chính xác càng cao (Hosmer and Lemeshow, 2000). Phân tích thống kê được tiến hành bằng cách sử dụng bộ phân tích thống kê lme4 package (Bates and Sarkar, 2007) ở chương trình R 3.2.1 (R Development Core Team, 2012).