Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng
- Phương pháp gieo mạ nuôi rầy: Lúa giống TN1 được ngâm no nước (48 giờ), sau đó rửa sạch và được ủ đến khi mầm dài bằng 2/3 hạt lúa, rễ dài bằng 1/3 hạt lúa (ngày ngâm, đêm ủ, trong 2 đêm) thì đem gieo trên đất đã rây mịn có trộn phân bón vi sinh theo tỷ lệ thích hợp. Gieo mạ vào khay có kích thước 32x24cm, (để vừa lồng nhỏ nuôi rầy) khi đã có một lớp đất dày 1 cm trong khay, sau khi gieo phủ 1 lớp đất mỏng 0,5cm.
- Phương pháp nuôi nhân: rầy thí nghiệm được tiến hành thu thập theo phương pháp của Viện lúa quốc tế (IRRI) dùng ống hút bằng miệng, 1 đầu ống hút rầy vào ống truyền vào ống thủy tinh to ở giữa chứa rầy. Sau đó rầy được chuyển vào hộp có kích thước (30 x 30 x 30) cm có khay lúa để có thể nuôi sống rầy trong thời gian dài và đẻ trứng. Quần thể rầy lưng trắng thu thập được tại các địa phương được nuôi trong phòng nuôi sâu tiêu chuẩn.
Nuôi riêng rẽ các quần thể rầy lưng trắng. Sau khi các quần thể rầy ở các địa phương đẻ hết, tập trung nuôi cho đến khi rầy trưởng thành. Sau đó, bắt rầy ra các lồng, mỗi lồng thả 200 rầy cái và 100 rầy đực trưởng thành. Sau 7 ngày sẽ cho hết rầy ra ngoài để đảm bảo độ đồng đều khi trứng nở. Sau 10 ngày giữ ở nhiệt độ 25oC, độ ẩm 85% rầy sẽ nở đều. Không cần thay thức ăn khi ở giai đoạn rầy cám. Đến khi rầy tuổi 2 sang tuổi 3 (rầy từ màu trắng sữa chuyển sang màu lưng trắng) thì thay thức ăn( quan sát thấy mạ chuyển màu vì bị rầy chích hút hết nhựa cây). Khi rầy tuổi lớn, san bớt rầy ra các lồng khác để đảm bảo đủ thức ăn và không gian cho rầy hoạt động.
- Phương pháp nuôi nhân dòng rầy mẫn cảm: dòng rầy lưng trắng mẫn cảm được nuôi nhân tương tự như các quần thể rầy lưng trắng đã thu thập.
- Phương pháp xác định LD50: Sử dụng phương pháp nhỏ giọt cục bộ của IRRI [29]. Việc đánh giá tiến hành trên rầy trưởng thành cái cánh dài đồng đều sau vũ hóa 2 ngày. Phương pháp này gồm các bước:
* Thu thập và nhân nuôi các quần thể rầy lưng trắng tại các địa phương theo phương pháp nuôi nhân và thu mẫu ở trên đã trình bày.
* Nuôi nhân dòng rầy lưng trắng mẫn cảm.
* Giai đoạn thăm dò:
+ Tiến hành các thử nghiệm thăm dò để mỗi loại thuốc trừ sâu chọn được thang với 5 nồng độ sao cho nồng độ cao nhất gây chết 90 – 95% số cá thể và nồng độ thấp nhất gây chết 5 – 10% số cá thể thí nghiệm.
+ Phương pháp pha: dung dịch có nồng độ cao được dùng làm dung dịch mẹ (liều 1), muốn chuyển sang nồng độ thấp hơn (liều2) theo công thức:
C1V1 = C2V2
Trong đó: C1: nồng độ thuốc ở liều 1 C2: nồng độ thuốc ở liều 2
V1: thể tích liều thuốc 1 cần để pha chế V2: thể tích liều thuốc 2 yêu cầu để pha chế.
Tương tự làm như vậy để được nồng độ thấp nhất (liều 5).
Vì các thuốc kỹ thuật không đạt độ tinh khiết tuyệt đối nên được hiệu chỉnh theo hệ số CF để thuốc đạt 100% hoạt chất.
Hệ số CF được hiệu chỉnh theo công thức 100%
CF =
* Giai đoạn thí nghiệm
+ Sau khi có nguồn rầy thu thập ở các địa phương và được nhân nuôi theo đúng tiêu chuẩn, hút 20 con rầy cái trưởng thành cánh dài 2 ngày tuổi cho vào ống tuýp dài 20 cm, đường kính 1,5 cm.
+ Làm rầy bất động (gây mê): cho ống tuýp đựng rầy vào van bình khí CO2, vặn van từ từ để xả khí CO2 vào ống tuýp với áp suất 15 lít/phút và để cố định như thế trong vòng 30 giây (đủ thời gian rầy bất động để bơm thuốc).
Sau đó, đổ rầy lên đĩa lõm đường kính 5 cm có căng vải màn ở mặt trên để chuẩn bị bơm thuốc.
+ Bơm thuốc: sau khi rầy được gây mê, dùng microsyranh nhỏ trực tiếp lờn mảnh lưng ngực trước của rầy với lượng đồng đều 0,2àl dung dịch thuốc pha trong aceton. Sau đó thả rầy vào cốc có mạ TN1 7 ngày tuổi và để trong phòng có nhiệt độ 25oC, ẩm độ 85%.
+ Ở công thức đối chứng, nhỏ lên mảnh lưng ngực trước của rầy lưng trắng mẫn cảm cũng với lượng 0,2àl dung dịch aceton.
+ Mỗi nồng độ thuốc thí nghiệm nhắc lại 3 lần.
* Theo dõi tỷ lệ chết:
Theo dõi sau 24 giờ và 48 giờ sau khi thí nghiệm. Những cá thể rầy không hoạt động bình thường được đếm là số con chết và những cá thể còn đậu trên cây mạ hoặc bám trên thành cốc (hoạt động bình thường khi chạm vào) là những con sống.
* Tớnh toỏn liều (dose) trờn một cơ thể sống (àg/g)
Chọn 20 con rầy cái trưởng thành cánh dài 2 ngày tuổi, cân trọng lượng cơ thể sống từng cá thể sau khi gây mê bằng khí CO2, sau đó chia cho 20 để tính ra trọng lượng cơ thể sống trung bình của một con rầy.
* Phương pháp tính toán giá trị LD50
Giá trị LD50 của từng loại thuốc trừ sâu thử nghiệm với các quần thể rầy lưng trắng được tính toán theo chương trình POLO PLUS (version 2.0).
Tỷ lệ chết giữa rầy lưng trắng thí nghiệm với thuốc trừ sâu có tương quan dương với đường thẳng y = ax+b. Các liều lượng của thuốc được logarit và tỷ lệ chết tương ứng với từng liều thử được chuyển thành probit. Mức độ tin cậy của giá trị LD50 được kiểm định bằng phương pháp χ2.
Chỉ số kháng Ri được xác định theo quy định của FAO
LD50 của loài dịch hại bị nghi là kháng thuốc
Ri = --- LD50 của cùng loài dịch hại nhưng chưa từng tiếp xúc với thuốc Nếu Ri ≥ 10: có thể kết luận nòi chống thuốc đã hình thành
LD50 được xác định theo công thức:
Nồng độ thuốc (àg/àl) x 0,20 àl LD50 = --- Trọng lượng trung bình con rầy (g)
- Phương pháp đánh giá hiệu quả của một số thuốc xử lý hạt giống trong phòng trừ rầy lưng trắng:
+ Nguồn rầy thí nghiệm: Rầy sạch được nuôi trong phòng nuôi sâu tiêu chuẩn.
+ Nhiệt độ nuôi duy trì: 23 – 250C
+ Lúa giống thí nghiệm: là giống lúa nhiễm rầy TN1 + Thuốc thí nghiệm là: Cruiser Plus 312.5FS
+ Bố trí thí nghiệm theo 2 công thức:
Công thức 2: Lượng thuốc dùng là: 60 ml/100 kg hạt giống Công thức đối chứng : Hạt giống không được xử lý thuốc
+ Cách xử lý hạt giống: Lúa giống TN1 được ngâm no nước (48 giờ), sau đó rửa sạch và được ủ đến khi hạt nảy mầm. Trước khi gieo 12h tiến hành xử lý hạt giống theo các liều lượng thí nghiệm. Trải đều lượng giống đã ngâm ủ ra bạt nilông, tiền hành phun nước thuốc lên hạt giống và trộn đảo đều đến khi hạt giống có màu hồng đồng nhất thì đem ủ lại khoảng 8 – 12h, sau đó đem gieo vào khay có kích thước 32x24cm (để vừa lồng nhỏ nuôi rầy), khi đã có một lớp đất dày 1 cm trong khay, sau khi gieo phủ 1 lớp đất mỏng 0,5cm.
+ Thời điểm thả rầy: 5;10;15 ngày sau gieo mạ + Số lượng thả cho 1 lồng: 100 rầy trưởng thành
+ Mỗi công thức thí nghiệm được bố trí vào 2 lồng riêng biệt( một lồng có xử lý thuốc và một lồng không xử lý thuốc).
+ Mỗi công thức nhắc lại 3 lần.
Các chỉ tiêu về điều tra hiệu lực của thuốc xử lý hạt giống:
+ Các chỉ tiêu về điều tra hiệu lực của thuốc xử lý hạt giống được tiến hành vào ngày thứ 3, 5, 7 sau khi thả rầy.
+ Hiệu lực thuốc được hiệu đính bằng công thức Abbot:
Hiệu lực (%) thuốc = [1-(Ta/Ca) x 100]
Trong đó : Ta là số sâu sống ở công thức xử lý thuốc sau phun Tb là số sâu sống ở công thức đối chứng sau phun