Hệ vi khuẩn hiếu khí ô nhiễm thực phẩm xuất phát từ nhiều nguồn gốc khác nhau, bao gồm cả vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn yếm khí tùy tiện (Helrick, 1997).
Vi sinh vật hiếu khí là những vi khuẩn phát triển trong điều kiện có oxy phân tử. Xác định chỉ tiêu TSVSVHK được xem là phương pháp tốt nhất để ước lượng số vi khuẩn xâm nhập vào thực phẩm, qua đó phản ánh tình trạng vệ sinh trong quá trình giết mổ, chế biến, độ tươi mới hay nguy cơ hư hỏng thực phẩm.
Theo Avery (2000) hệ vi khuẩn có mặt trong thịt được chia thành 2 nhóm, dựa theo mức độ và điều kiện phát triển của chúng gồm:
+ Nhóm vi khuẩn ưa nhiệt: Phát triển tốt ở nhiệt độ 37ºC và ngừng phát triển ở nhiệt độ thấp khoảng 1ºC.
+ Nhóm vi khuẩn ưa lạnh: Sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ thấp hơn.
Việc phân nhóm này chỉ mang ý nghĩa tương đối.
Ingram và Simonsen (1980) cho rằng vi khuẩn ưa lạnh có thể phát triển trong phạm vi nhiệt độ từ 0oC - 30oC, song nhiệt độ tối ưu là 10oC - 15oC.
TSVSVHK trong thịt có thể thay đổi theo thời gian, điều kiện sản xuất và bảo quản. Vi khuẩn ưa nhiệt có thể xâm nhập vào thân thịt ngay sau khi giết mổ, bởi vậy cần kiểm tra nhóm vi khuẩn ưa nhiệt ở nhiệt độ nuôi cấy từ 35oC - 37oC.
Theo TCVN (4884:2005) nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm có thể áp dụng cho mọi vùng là 30°C.
Sự phát hiện số lượng vi sinh vật hiếu khí quá cao trong thân thịt chứng tỏ điều kiện vệ sinh trong quá trình giết mổ là không tốt. Chỉ tiêu này được coi là nhân tố chỉ điểm về vệ sinh thực phẩm. Tuy nhiên không thể đánh giá rằng TSVSVHK ở mức độ thấp có nghĩa là sản phẩm an toàn. Trong một số trường hợp, chỉ tiêu TSVSVHK thấp nhưng chứa độc tố gây ngộ độc của vi khuẩn, ví dụ như ngộ độc enterotoxin của S. aureus. Hay trong trường hợp thực phẩm lên men không thể đánh giá chất lượng vệ sinh theo tiêu chí này.
2.6.2. Vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc họ Enterobacteriaceae là trực khuẩn bắt màu gram (-), hình gậy ngắn 2 đầu tròn, có lông di động mạnh, không sinh nha bào, một số có màng nhầy và có thể có giáp mô. E. coli được Buchner tìm ra vào năm 1885 và được Escherich nghiên cứu đầy đủ năm 1886. E. coli là vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy tiện, có thể sinh trưởng phát triển trong khoảng nhiệt độ 7°C - 48°C, nhiệt độ thích hợp nhất là 37°C. Chúng có thể phát triển được pH trong khoảng 4,4 - 8,0 và dải tối ưu là pH từ 7,2 - 7,4.
E. coli thường được dùng làm chỉ tiêu chỉ điểm vệ sinh vì theo các nghiên cứu sinh thái học chỉ ra rằng E. coli có nguồn gốc từ đường tiêu hoá của người và các động vật máu nóng.
E. coli được đặc trưng bởi enzym ò-galactose và enzym ò-Glucoronidase nên nó có tính chất lên men sinh hơi mạnh đường galactose và lactose. Khả năng sinh axit, indole từ Tryptophan là tính chất đặc trưng nhất của E. coli hơn cả tính chất lên men sinh hơi lactose.
Có 3 loại kháng nguyên được dùng để định nhóm kháng nguyên của E. coli : kháng nguyên O (kháng nguyên thân chịu nhiệt), kháng nguyên K (kháng nguyên thân không chịu nhiệt) và kháng nguyên H (kháng nguyên lông không chịu nhiệt). Trong đó kháng nguyên O được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn.
Chủng E. coli được phân loại theo tính chất gây bệnh và mỗi nhóm có cơ chế gây bệnh khác nhau. Có 6 nhóm E. coli :
Enteropathogennic E. coli (EPEC): E. coli gây bệnh đường ruột.
Entrotoxigenic E. coli (ETEC): E. coli sinh độc tố ruột.
Enteroinvasive E. coli (EIEC): E. coli xâm nhập tế bào ruột . Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC): E. coli gây xuất huyết.
Verotoxinproducing E. coli (VTEC): E. coli sinh độc tố verotoxin
Enteroadherent aggregative (EA-AggEC): E. coli tập kết ở ruột, gây bệnh chủ yếu ở trẻ em.
Vi khuẩn E. coli sản sinh hai loại độc tố là độc tố chịu nhiệt và độc tố không chịu nhiệt:
- Độc tố chịu nhiệt ST (Heat Stable Enterotoxin): Chịu được nhiệt độ 120°C trong vòng 1 giờ và bền vững ở nhiệt độ thấp (bảo quản ở 20°C) nhưng bị phá hủy nhanh chóng khi hấp cao áp. Độc tố ST kích hoạt hệ thống men Guanylate Cyclase tăng cường hoạt động của GMPc, kích thích bài tiết nước, ngăn cản hấp thu HCO3-, Na+.
- Độc tố không chịu nhiệt LT (Heat Labile Toxin): Độc tố vô hoạt ở nhiệt độ 600C trong vòng 15 phút. Độc tố LT kích hoạt hệ thống men Adenylate Cyclase - tăng cường hoạt động AMPc, ngăn cản hấp thu Na+, Cl- từ xoang ruột vào tế bào, bài tiết nước từ mô bào xoang ruột gây ỉa chảy.
Triệu chứng ngộ độc là đau bụng dữ dội, ỉa chảy, trong trường hợp nặng
có thể ỉa chảy ra máu, sốt và nôn mửa là dấu hiệu điển hình. Bệnh nhân có thể khỏi sau 10 ngày. Tuy nhiên một số trường hợp có thể gây tử vong đặc biệt ở người già và trẻ em.
Do vậy, xác định tổng số E. coli là việc làm bắt buộc đối với thực phẩm lạnh đông có nguồn gốc động vật và là chỉ tiêu để đánh giá tình trạng vệ sinh thực phẩm.
2.6.3. Vi khuẩn Salmonella
Salmonella là những vi khuẩn thuộc họ Enterobacteria, là trực khuẩn gram âm, hiếu khí, có khả năng di động, không sinh bào tử, không sinh indole hoặc acetone, catalase dương tính, oxidase âm tính lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không phân giải ure, hầu hết các chủng đều sinh H2S.
Cho đến nay đã xác định được 2339 serotype thuộc giống Salmonella. Các serotype này được chia theo hệ thống của Kaffmann - White dựa trên công thức kháng nguyên O (kháng nguyên somatic) và kháng nguyên tiên mao H. Ngoài một số được đặt tên riêng như Typhi (S. typhy), Paratyphy (S. paratyphy),…hầu hết các serotype khác được ký hiêu bằng công thức kháng nguyên.
Salmonella dễ nuôi cấy, có thể tồn tại ở 5°C - 45°C nhiệt độ thích hợp là 37°C, pH từ 4,5 - 9,0 tối ưu là 6,5 - 7,5 và được lây nhiễm chủ yếu qua đường tiêu hóa. 49% trường hợp ngộ độc thực phẩm thịt là do thịt bị nhiễm Salmonella (Lowry and Bates, 1989).
Độc tố của Salmonella có 2 loại gồm nội độc tố và ngoại độc tố.
Độc tố đường ruột của Salmonella sản sinh ra có 2 thành phần gồm độc tố thẩm xuất nhanh và độc tố thẩm xuất chậm.
- Độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc và hoạt tính giống với độc tố chịu nhiệt (ST) của E. coli. Độc tố này chịu được nhiệt độ 100°C trong 4 giờ nhưng bị phá hủy nhanh nếu hấp cao áp và bền vững ở nhiệt độ thấp thậm chí là ở nhiệt độ âm 20°C. Độc tố chịu nhiệt thực hiện khả năng thẩm xuất nhanh sau 1 giờ và có thể kéo dài 48 giờ.
- Độc tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc và thành phần giống độc tố không chịu nhiệt (LT) của E. coli, độc tố này bị phá hủy ở nhiệt độ 70°C sau 30 phút và 56°C sau 4 giờ. Độc tố không chịu nhiệt của Salmonella làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải dẫn đến quá trình rút nước từ cơ thể
vào ruột non, gây tiêu chảy. Độc tố này thực hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18 - 24 giờ có thể kéo dài 26 - 48 giờ.
Vi khuẩn Salmonella có thể sinh trưởng ở thực phẩm nhưng không sinh độc tố, khi chúng xâm nhập vào trong ruột hoặc trong máu mới sinh độc tố gây viêm niêm mạc ruột non. Các tế bào vi khuẩn bị chết tự phân giải làm phóng thích nội độc tố.
2.6.4. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
Vi khuẩn Staphylococcus aureus (S. aureus) thuộc họ Micrococcacea.
S. aureus là vi khuẩn hình cầu, bắt màu Gram (+), không sinh nha bào, không có giáp mô và lông, không di động, có khả năng gây đông huyết tương. Trong bệnh phẩm S. aureus thường đứng thành đám nhỏ hình chùm nho.
Vi khuẩn S. aureus sống hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện, dễ nuôi cấy trên các môi trường thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37°C, pH 7,0 - 7,5. Nhìn chung tụ cầu phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 7°C - 47,8°C và tổng hợp độc tố trong khoảng từ 10°C - 46°C.
S. aureus được xem là một trong ba tác nhân chính của các vụ ngộ độc thực phẩm ở nhiều nước chỉ sau Salmonella và C. perfringens (Rosec J.P et al., 1996; Fueyo J.M et al., 2000; Viktoria A. et al., 2001; Normanno G. et al., 2005). S. aureus gây ngộ độc thực phẩm do tạo độc tố ruột enterotoxin làm xuất hiện các triệu chứng: buồn nôn, đau bụng, đi ngoài, vã mồ hôi, đau đầu, có thể hạ thân nhiệt... Triệu chứng ngộ độc xảy ra nhanh, từ 3 - 6 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm, tùy vào lượng thực phẩm đã dùng, lượng độc tố có trong thực phẩm và độ mẫn cảm với độc tố cũng như sức khỏe của từng người. Các triệu chứng thường chỉ biểu hiện trong một thời gian ngắn, khoảng 6 - 8 giờ và hết bệnh sau 1 - 2 ngày (Trần Linh Thước, 2002; Bremer P.J. et al., 2004). Tuy nhiên khoảng 10% trường hợp người bệnh bị mất nhiều nước cần phải nhập viện để truyền dịch (Normanno G. et al., 2004). Người bị ngộ độc thực phẩm do S. aureus có thể bị hội chứng shock độc tố do chúng tạo ra siêu kháng nguyên trong máu (Kenneth Todar, 2005). Thời gian gây bệnh ngắn nhưng những vụ ngộ độc thực phẩm do S.
aureus để lại hậu quả không nhỏ.
S. aureus có mặt ở khắp nơi trong môi trường. Trên da tụ cầu thường có ở cánh tay, bàn tay và mặt với tỷ lệ từ 5% - 30%. Có 10% - 50% dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang S. aureus (Bremer P.J et al.,2004). Khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S. aureus cũng rất lớn do chúng phân bố ở khắp
nơi và có khả năng sinh độc tố. Hầu hết các vụ ngộ độc S. aureus là do quá trình chế biến hoặc bảo quản thực phẩm không tốt. S. aureus thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm do tay người chế biến bị trầy xước hay do ho, hắt hơi. Việc bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ không phù hợp cũng rất quan trọng. Khi thực phẩm đã nhiễm S. aureus, chúng sẽ tăng nhanh số lượng do chúng phát triển được trong khoảng nhiệt độ rất lớn từ 7°C - 48°C. Điều đáng lo ngại độc tố được tạo ra trong suốt quá trình phát triển của tụ cầu nhưng lại không gây ảnh hưởng đến cảm quan của thực phẩm, do đó ít được chú ý (Mary K. S. et al.,, 2002). Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh của quá trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không tốt. Tuy nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm đó sẽ gây độc, điều đó chỉ xảy ra khi S. aureus được phân lập tạo độc tố. Ngược lại, chỉ với một lượng nhỏ S. aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ độc (Reginald W. B. et al.,2001).
Tới nay đã có 18 loại độc tố của tụ cầu cùng cấu trúc gen mã hoá được phát hiện, phổ biến là độc tố A; B; C1 ; C2; D; E. Chỉ có các chủng tụ cầu có men coagulase mới có khả năng sản sinh độc tố này. Độc tố ruột enterotoxin rất bền với nhiệt độ: Nhiệt độ Pasteur hóa (72°C/15 phút) và nhiệt độ 143,3°C/9 giây không đủ sức vô hoạt độc tố ruột. Enterotoxin đề kháng với enzym phân giải protein như: pepsine, papain, trypsine...
Trong số các chủng S. aureus phân lập được trong thực phẩm, thì tỷ lệ các chủng mang gen sinh độc tố ước tính khoảng 25% (Bergdoll, 1989). Tuy nhiên, điều đó cũng còn phụ thuộc vào từng loại thực phẩm và từng nước khác nhau.
Hiện nay tại Việt Nam cũng đang triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc xác định vi khuẩn S. aureus và xác định độc tố ruột bằng kỹ thuật ELISA . Kết quả cho thấy có 19/72 chủng S. aureus (26,8%) chủng có khả năng sinh độc tố , trong đó độc tố SEA, SEB là 42%, SEC là 11% và chủng mang hai gen SEA và SED là 5% (Nguyễn Đỗ Phúc và cs., 2006).
2.6.5. Vi khuẩn Clostridium perfringens
Clostridium perfringens (C. perfringens) còn có tên khác là Clostridium welchii được Oen và Natan phân lập từ năm 1982 trong tổ chức có hơi của người chết. Vi khuẩn C. perfringens thuộc họ Bacillaceae, giống Clostridiaceae.
C. perfringens là trực khuẩn, hai đầu hơi tròn. Vi khuẩn không có lông, không có khả năng di động, có khả năng hình thành nha bào trong môi trường trung
tính hoặc kiềm. Vi khuẩn bắt màu Gram (+), có khả năng khử sunfite, yếm khí tuyệt đối, mọc tốt trong các môi trường yếm khí thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37°C.
Môi trường Tryptone Sulfite Cycloserin (TSC) là môi trường đặc trưng để xác định C. perfringens. Trong môi trường TSC vi khuẩn được ủ trong điều kiện kỵ khí cho khuẩn lạc điển hình màu đen do có khả năng khử sunfit thành sunfua.
C. perfringens là một trong những nguyên nhân thường gặp gây ngộ độc thực phẩm. C. perfringens gây ngộ độc khi có một lượng lớn vi khuẩn trong đường tiêu hóa (>106/gam thực phẩm), khi đó vi khuẩn hình thành nha bào trong ruột, giải phóng nội độc tố.
C. perfringens sản sinh ra 6 type độc tố A; B; C; D; E; F trong đó A và F là type độc tố chủ yếu gây ngộ độc thức ăn. C. perfringens type A là nguyên nhân gây bệnh ỉa chảy sau khi ăn phải thức ăn nhiễm khuẩn từ 6 - 12 giờ, type này có nhiều trong đất, trên thực phẩm. C. perfringens type C tìm thấy trên nhiều loại sản phẩm và phủ tạng của động vật, nó là nguyên nhân của viêm ruột hoại tử trầm trọng với triệu chứng đau bụng, buồn nôn, ỉa chảy. Thông thường sau khi ăn thức ăn nhiễm khuẩn 10 - 12 giờ có khi 6 - 8 giờ (không quá 24 giờ) xuất hiện bệnh với các triệu chứng đau bụng, ỉa chảy, phân lỏng toàn nước, có khi lẫn máu, mủ, thỉnh thoảng có trường hợp nôn mửa, viêm ruột, viêm dạ dày. Bệnh thường khỏi sau vài ngày nhưng cũng có trường hợp gây tử vong.
2.6.6. Coliforms tổng số
Từ năm 1904, Coliforms tổng số được sử dụng như vi sinh vật chỉ điểm sự có mặt của phân trong nước và thức ăn. Coliforms tổng số là những trực khuẩn đường ruột, bắt màu Gram (-), hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện, có khả năng phát triển trên môi trường muối mật hoặc các chất hoạt tính bề mặt khác có tính chất ức chế tương tự, không sinh nha bào, lên men sinh hơi đường lactose, sinh axit và aldehyt trong vòng 24 - 48 giờ ở 30 - 37°C. Nhóm Coliforms gồm 4 giống:
Escherichia, Citrobacter, Klebsiella và Enterbacter.
Coliforms tổng số được coi là nhóm vi sinh vật chỉ thị bởi số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số Coliforms trong thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh cũng khá cao. Như vậy, chỉ tiêu Coliforms tổng số có giá trị như một chỉ thị về vệ sinh đối với thực phẩm và tỏ ra khá hữu hiệu trong chương trình an toàn chất lượng thực phẩm theo HACCP.