Chương II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp bào chế tiểu phân nano paclitaxel - artesunat Phương pháp bốc hơi dung môi hữu cơ từ nhũ tương (dầu/nước).
Pha dầu chứa dược chất PTX, ART, PLGA và dung môi hữu cơ là Dicloromethan sẽ được nhỏ từng giọt với tốc độ 2,5ml/phút bằng micro pipet tự động vào pha nước chứa chất diện hoạt (Ví dụ: Tween 80, Cremophor RH40, PVA) rồi được đồng nhất hóa bằng siêu âm kếp hợp với khuấy từ đồng thời đặt trong khay đựng nước đá. Bốc hơi dung môi bằng khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong vòng 4 giờ [2], [23], [57].
29
Hình 2.1. Sơ đồ mô tả quá trình bào chế tiểu phân nano PTX-ART.
2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano PTX-ART 2.2.2.1 Đánh giá phân bố kích thước tiểu phân và thế zeta
Kích thước tiểu phân được xác định bằng phương pháp tán xạ lazer. Nguyên lý chung của phương pháp là khi chiếu chùm tia lazer vào các tiểu phân có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau. Bằng cách đo cường độ ánh sáng tán xạ có thể xác định được kích thước tiểu phân.
Sử sụng máy phân tích kích thước tiểu phân Zetasizer Nano ZS90 đo kích thước trong khoảng 0,01 – 10000 nm. Trước khi đo, tiến hành pha loãng chế phẩm nhiều lần bằng nước cất đã lọc qua màng 0,2 μm để tránh hiện tượng đa tán xạ, mặt khác hỗn dịch khi đo chỉ số “Count Rate” phải nằm trong khoảng 200 – 400 kcps để kết quả mẫu đo thu được là chính xác nhất. Mẫu pha loãng được đo ở điều kiện hệ số khúc xạ ánh sáng; nhiệt độ đo 25oC. Phân bố kích thước tiểu phân cũng được dùng để đánh giá hệ tiểu phân nano thông qua chỉ số đa phân tán (PDI), chỉ số PDI càng gần bằng 0 thì các tiểu phân trong hệ có kích thước càng đồng đều.
Pha dầu: PTX, ART, PLGA, dung môi hữu cơ trong
Dicloromethan
Pha nước: Chất diện hoạt (Tween 80, Cremophor RH40, PVA) trong nước.
Siêu âm/Đồng nhất hóa
Nhũ tương
Hỗn dịch
Nano PTX-ART/PLGA
Bốc hơi dung môi
Siêu ly tâm
30
Thế Zeta được xác định gián tiếp thông qua linh độ điện di của tiểu phân nano khi đặt trong điện trường.
2.2.2.2. Đánh giá hiệu suất mang thuốc trong tiểu phân nano
Xác định lượng dược chất tự do: Lấy chính xác một thể tích hỗn dịch chứa tiểu phân nano PTX-ART sẽ đưa vào ống ly tâm có màng siêu lọc 10000Da. Tiến hành ly tâm 5000 vòng/phút trong thời gian 60 phút ở nhiệt độ 100C, lấy phần dịch lọc trong phía dưới màng siêu lọc tiêm vào hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng PTX và ART tự do.
Dự kiến điều kiện tiến hành phân tích đồng thời hai chất bằng HPLC như sau [65], [66]:
+ Cột sắc ký: Căn cứ vào điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm sẽ tiến hành khảo sát trên một số loại cột sắc ký.
+ Đệm phosphat: Dung dịch kali dihydrophosphat 0,05M ở pH đến 3.
+ Pha động: Acetonitril và đệm phosphat.
+ Detector UV - Vis: 210 nm.
+ Thể tớch tiờm mẫu: 50 àl.
Hiệu suất tạo nano của mỗi dược chất được tính theo công thức sau:
EE (%) = Ctp - Ctd
x 100%
Ctp
Trong đó:
+ Ctp: Là nồng độ toàn phần của mỗi loại dược chất trong hỗn dịch nano (àg/ml).
+ Ctd: Là nồng độ tự do của mỗi loại dược chất trong hỗn dịch nano (àg/ml).
Hiệu suất mang thuốc của hệ tiểu phân nano.
LC (%) = MNano
x 100%
MHệ
Trong đó:
+ MNano: Lần lượt là khối lượng của ART và PTX được tạo thành nano (mg) + MHệ: Là tổng khối lượng của hệ nano bao gồm hai dược chất và tá dược sử dụng bào chế nano (mg).
31
2.2.2.3. Đánh giá độ ổn định KTTP của hỗn dịch nano trong các điều kiện ly tâm khác nhau.
Quá trình ly tâm ảnh hưởng nhiều đến các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano, đặc biệt là KTTP. Vì vậy, việc đánh giá lại đặc tính này sau quá trình ly tâm cần được thực hiện. Trong quá trình bào chế hỗn dịch chứa tiểu phân nano PTX-ART/PLGA, quá trình ly tâm được tiến hành bao gồm việc sử dụng ống ly tâm có hoặc không sử dụng màng siêu lọc 10000Da.
Cách tiến hành:
- Hỗn dịch chứa tiểu phân nano PTX-ART/PLGA được đưa vào các ống ly tâm.
- Tiến hành ly tâm với tốc độ 8000, 10000 và 12000 vòng/phút trong một thời gian (không sử dụng màng siêu lọc) và 5000 vòng/phút trong một thời gian (có sử dụng màng siêu lọc), nhiệt độ ly tâm 10oC.
- Lấy phần dịch trong và tiến hành đo KTTP theo mục 2.2.2.1.
- Phân tán lại phần cắn vào 1 thể tích nhỏ nước cất bằng cách siêu âm, sau đó tiến hành đánh giá cảm quan hỗn dịch khi phân tán lại và đo KTTP theo mục 2.2.2.1.
Tiêu chí đánh giá mức độ hiệu quả của quá trình ly tâm là sự ổn định về KTTP và khả năng cho hiệu suất thu hồi sản phẩm tốt.
2.2.2.4. Đánh giá độ ổn định KTTP của hỗn dịch nano trong điều kiện khắc nghiệt.
Độ ổn định về KTTP của hệ tiểu phân nano PTX-ART/PLGA trong điều kiện khắc nghiệt của thử nghiệm đông đá - rã đông (freeze - thaw) được tiến hành như sau: Hỗn dịch đặc chứa tiểu phân nano sau quá trình ly tâm - rửa được tiến hành đông đá hoàn toàn ở - 40oC trong 48 giờ, sau đó để rã đông hoàn toàn ở 25oC. Một số mẫu chúng tôi tiến hành phối hợp chất bảo vệ (dextrose khan, D (+) trehalose dihydrat, sucrose, manitol) vào 10 ml hỗn dịch đặc chứa tiểu phân nano, nồng độ chất bảo vệ trong hỗn dịch mức 5%. Sau đó các mẫu cũng được tiến hành đông đá và rã đông trong điều kiện như trên. Sự thay đổi KTTP nano trước và sau thử nghiệm được thể hiện bằng tỷ số Sf/Si, trong đó Sf là KTTP sau thử nghiệm, Si là KTTP trước khi thử nghiệm.
32 2.2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Mỗi mẫu được làm lặp lại với n = 3, sử dụng phần mềm Excel 2013 của Microsoft Office để xử lý số liệu thống kê.
33