Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.1. Khảo sát phương pháp chuẩn bị dịch tạo bọt
Dịch tạo bọt có thành phần chính là các phospholipid. Trạng thái và cách sắp xếp các phospholipid trong dịch trước khi tạo bọt có ảnh hưởng mạnh tới chất lượng vi bọt tạo thành, do quá trình tạo bọt là quá trình chuyển dịch các tiểu phân phospholipid phân tán trong dịch sang bề mặt phân cách khí – lỏng của vi bọt. Quá trình chuẩn bị dịch tạo bọt gồm có phân tán phospholipid trong nước, thêm chất diện hoạt và siêu âm phân tán. Để tiến hành khảo sát phương pháp chuẩn bị dịch tạo bọt, sử dụng phospholipid HSPC (phosphatidylcholin đậu nành được hydrogen hóa) nồng độ 1mg/ml và chất diện hoạt là Poloxamer 407 nồng độ 0,5mg/ml, cố định các thông số như thời gian tạo bọt 1 phút, công suất siêu âm 100%, nhịp xung siêu âm là d= 2:1 (siêu âm hai nhịp, nghỉ một nhịp) và dịch sau tạo bọt được làm nguội về nhiệt độ phòng bằng cách ngâm vào nước ở 250C, sau đó được pha loãng 5 lần bằng dung dịch salin đệm phosphat pH 7,4 và chuyển vào ống nghiệm có đường kính 1,4 cm để tiến hành đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng vi bọt.
3.1.1.1. Khảo sát phương pháp phân tán phospholipi trong nước
Thành phần công thức và thông số tạo bọt như phần 3.1.1, chọn thời gian siêu âm phân tán 1 phút, để tiến hành khảo sát hai phương pháp 1 và 2 trong chuẩn bị dịch tạo bọt như phần a mục 2.3.1. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1.
31
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp phân tán phospholipi trong nước
Phương pháp phân tán Phương pháp 1 Phương pháp 2 Phân bố kích thước
tiểu phân trong dịch tạo bọt
2- 4 àm (Hỡnh 19. PL)
20-300 nm (68%) và 3-8 àm (25%)
(Hình 20. PL) Đặc điểm dịch bọt sau
pha loãng
Có nhiều tiểu phân trắng nổi lên phía trên ống nghiệm, dịch phía dưới
ống nghiệm trong
Sau khi bọt nổi lên phía trên, dịch phía dưới hơi
đục
Hình thức bọt Cầu
Thời gian phân lớp 30 ± 5 phút 60 ±7 phút
Số lượng vi bọt trên
một vi trường 103 ± 8 196 ± 23
Hình 3.1. Hình ảnh vi bọt trên tiêu bản sử dụng phương pháp 1 ( ên trái) và phương pháp 2 ( ên phải) để phân tán phospholipid
32
Nhận xét: Chuẩn bị dịch tạo bọt bằng phương pháp 1 chưa phân tán hết phospholipid vào nước, kích thước tiểu phân phospholipid lớn và số lượng phospholipid tham gia tạo bọt ít nên số lượng bọt rất ít, phospholipid dư nhiều, nổi lên trên miệng ống nghiệm ở dạng hạt rắn ban đầu. phương pháp 2, phospholipid được phân tán tốt hơn và tham gia tạo bọt nhiều hơn, tạo ra nhiều bọt hơn. Lựa chọn phương pháp 2 đun nóng, siêu âm phân tán cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.2. Khảo sát thời điểm thêm chất diện hoạt
Chất diện hoạt làm tăng sự phân tán phospholipid trong nước, đồng thời có thể tham gia cấu tạo nên một số cấu trúc của phospholipid trong nước. Tiến hành đun nóng dịch phospholipid tới khi không còn thấy tiểu phân bằng mắt thường, thêm chất diện hoạt trước hoặc sau khi siêu âm phân tán và thời gian siêu âm phân tán 1 phút để khảo sát thời điểm thêm chất diện hoạt. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời điểm thêm chất diện hoạt Thời điểm thêm chất
diện hoạt
Trước siêu âm phân
tán Sau siêu âm phân tán Phân bố kích thước
tiểu phân trong dịch tạo bọt
20-300 nm (68%) và 3-8 àm (25%)
20-400 nm (70%) và 4-9 àm (21%) (Hình 21. PL) Đặc điểm dịch bọt sau
pha loãng
Cho chất diện hoạt trước siêu âm phân tán thì dịch sau tạo bọt trong hơn.
Hình thức vi bọt Cầu
Thời gian phân lớp 60 ± 7 phút 58 ± 7 phút Số lượng vi bọt trên
một vi trường 196 ± 18 146 ± 12
Hình ảnh vi bọt trên vi
trường Hình 1. PL Hình 2. PL
33
Hình 3.2. Đồ thị phân bố k ch thước vi bọt khi cho chất diện hoạt trước (Trước SAPT) và sau siêu âm phân tán (Sau SAPT)
Nhận xét: Thêm chất diện hoạt trước khi siêu âm phân tán thì kích thước tiểu phân trong dịch tạo bọt nhỏ hơn so với khi cho chất diện hoạt sau siêu âm phân tán, do đó số lượng bọt trên một vi trường khi cho chất diện hoạt trước siêu âm phân tán nhiều hơn so với khi cho sau. Tuy nhiên, kích thước và phân bố kích thước vi bọt lại khác nhau không đáng kể. Lựa chọn thời điểm cho chất diện hoạt trước khi siêu âm phân tán cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm phân tán
Thời gian siêu âm phân tán ảnh hưởng tới kích thước và phân bố kích thước tiểu phân trong dịch tạo bọt, do đó cũng sẽ ảnh hưởng tới vi bọt tạo thành. Tiến hành chuẩn bị dịch tạo bọt bằng phương pháp đun nóng tới khi dịch đồng nhất rồi đem siêu âm phân tán với các khoảng thời gian khác nhau, sau đó đem tạo bọt để khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm phân tán tới một số chỉ tiêu chất lượng bọt tạo thành. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.3.
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0 2 4 6 8 10
số lượng
Đường kính (micromet)
Sau SAPT Trước SAPT
34
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm phân tán Thời gian siêu
âm phân tán 1 phút 2 phút 3 phút
Phân bố kích thước tiểu phân trong dịch tạo bọt
20-1000 nm (93%) (Hình 22. PL)
20-300 nm (68%), 3-8 àm (25%)
80-500 nm (82%) (Hình 23. PL) Đặc điểm dịch
bọt sau pha loãng
Bọt di chuyển lên, dịch phía dưới hơi đục
Bọt di chuyển lên phía trên, dịch phía dưới trong
Bọt di chuyển lên phía trên, dịch phía dưới
trong
Hình thức vi bọt Cầu
Thời gian phân
lớp (phút) 50 ±7 55 ± 5 53 ± 5
Số lượng vi bọt trên một vi trường
186 ± 23 277 ± 22 239
Hình ảnh vi bọt
trên tiêu bản Hình 1. PL Hình 3. PL Hình 4. PL
Hình 3.3. Đồ thị phân bố k ch thước vi bọt với thời gian siêu âm phân tán 1; 2 và 3 phút
Nhận xét: Thời gian siêu âm phân tán càng tăng thì kích thước tiểu phân trong dịch tạo bọt càng giảm và phân bố kích thước tiểu phân cũng tập trung
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 2 4 6 8 10
số lƣợng
Đường k nh (micromet)
1phút 2 phút 3 phút
35
hơn, có sự chênh lệch rõ ràng về số lượng vi bọt khi siêu âm phân tán 1 phút với 2 phút. Khi siêu âm phân tán 1 phút, một số phospholipid có kích thước lớn, rất khó tham gia tạo bọt, do vậy số lượng bọt tạo thành cũng ít hơn. Khi siêu âm phân tán 3 phút thì kích thước tiểu phân trong dịch tạo bọt nhỏ hơn siêu âm 2 phút, kích thước và phân bố kích thước bọt cũng nhỏ hơn nhưng siêu âm phân tán 3 phút thì dịch trước tạo bọt có xuất hiện vết đen dưới đáy ống nghiệm, có thể phospholipid bị oxy hóa do nhiệt cục bộ quá cao hoặc do H2O2. Lựa chọn thời gian siêu âm phân tán 2 phút để tiến hành các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.4. So sánh với phương pháp tạo màng phim
Quá trình siêu âm phân tán hay hydrat hóa màng phim đều có thể tạo ra liposome trong dịch tạo bọt. Trong quá trình tạo bọt, phospholipid sẽ từ liposome chuyển sang bề mặt phân cách pha lỏng – khí.
Tiến hành chuẩn bị dịch tạo bọt theo phương pháp 2 (cho chất diện hoạt trước và siêu âm phân tán 2 phút) và phương pháp 3 sau đó siêu âm tạo bọt cùng thông số thiết bị. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả so sánh với phương pháp tạo màng phim Phương pháp phân tán Phương pháp 2
(pp2)
Phương pháp 3 (pp3) Phân bố kích thước tiểu phân
trong dịch tạo bọt
20-300 nm (68%), 3-8 àm (25%)
20-400 nm (91%) (Hình 24. PL) Đặc điểm dịch bọt sau pha loãng Sau khi bọt di chuyển lên trên, dịch
phía dưới trong
Hình thức vi bọt Cầu
Thời gian phân lớp (phút) 55 ± 5 58 ± 7
Số lượng vi bọt trên một vi trường
277 ± 22 178 ± 13 Hình ảnh vi bọt trên tiêu bản Hình 3. PL Hình 5. PL
36
Hình 3.4. Đồ thị phân bố k ch thước vi bọt tạo thành khi phân tán phospholipid bằng phương pháp 2 (pp2) và phương pháp 3 (pp3)
Nhận xét: Phương pháp hydrat hóa màng phim giúp làm giảm đáng kể kích thước tiểu phân trong dịch tạo bọt nhưng số lượng bọt tạo thành lại ít hơn so với phương pháp 2. Sự hydrat hóa màng phim có thể đã làm phospholipid trong dịch chủ yếu ở dạng liposome bền vững hơn và đều hơn so với phương pháp đun nóng rồi siêu âm phân tán. Khi ở dạng liposome bền vững thì sự linh hoạt của phospholipid sẽ giảm, dẫn tới số lượng bọt được tạo thành sẽ ít hơn. Lựa chọn phương pháp 2 để chuẩn bị dịch tạo bọt cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.5. hảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tạo ọt
Nhiệt độ ảnh hưởng mạnh tới sự linh động của phospholipid trong dịch tạo bọt. Do vậy, tiến hành khảo sát ba mức nhiệt độ dịch tạo bọt là 250C, 400C và 650C. Công thức và phương pháp chuẩn bị dịch tạo bọt và thông số thiết bị tạo bọt được giữ cố định như lựa chọn ở các khảo sát trước. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ dịch tạo bọt tới một số chỉ tiêu chất lượng bọt tạo thành được thể hiện ở bảng 3.5.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 2 4 6 8 10
Số lƣợng
Đường k nh (micromet)
pp2 pp3
37
Bảng 3.5. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ dịch tạo bọt tới một số chỉ tiêu chất lƣợng bọt tạo thành
Nhiệt độ ịch tạo
ọt 250C 400C 650C
Đặc điểm dịch bọt sau pha loãng
Vi bọt di chuyển chậm lên trên, dịch phía dưới sau khi bọt di chuyển lên trên
đục
Sau khi bọt di chuyển lên trên,
dịch phía dưới đục
Sau khi vi bọt di chuyển lên trên, dịch phía
dưới trong
Hình thức vi bọt Cầu
Thời gian phân lớp 70 ± 10 (phút) 50 ± 8 (phút) 55 ± 5 (phút) Số lượng vi bọt trên
một vi trường 93 ± 7 130 ± 12 277 ± 22
Hình ảnh vi bọt trên
tiêu bản Hình 6. PL Hình 7. PL Hình 3. PL
Nhận xét: Khi tạo bọt ở 250C và 400C, số lượng bọt tạo thành rất ít, chỉ bằng một nửa so với tạo bọt ở 650C, dịch pha loãng đục cho thấy một lượng lớn phospholipid đã không tham gia tạo bọt. Quan sát trên vi trường nhận thấy, một số bọt tạo ra ở điều kiện 650C bị vỡ trong khoảng thời gian ngắn, phần lớn còn lại bền vững. Trong khi đó ở hai nhiệt độ còn lại, bọt tạo ra ít nhưng không nhận thấy hiện tượng vỡ nhanh. Lựa chọn nhiệt độ tạo bọt ở 650C cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.6. Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp làm nguội dịch sau tạo ọt
Cách làm nguội dịch sau tạo bọt ảnh hưởng đến sự sắp xếp cấu trúc phospholipid trên bề mặt vi bọt. Dịch sau tạo bọt đo đó được làm nguội theo nhiều cách khác nhau. Làm nguội về nhiệt độ phòng bằng cách ngâm vào cốc
38
nước đá hoặc các cốc nước ở nhiệt độ 250C, 400C hay để nguội tự nhiên về nhiệt độ 250C. Quan sát một số chỉ tiêu chất lượng bọt sau khi làm lạnh bằng các phương pháp được kết quả thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp làm nguội dịch sau tạo ọt
Làm lạnh dịch sau tạo
bọt
Nước đá Nước ở
250C Nước ở 400C Để nguội tự nhiên
Đặc điểm dịch bọt sau pha loãng
Dịch đục, không thấy sự di chuyển
của bọt
Sau khi vi bọt di chuyển lên
trên, dịch phía dưới
trong
Sau khi vi bọt di chuyển
lên trên, dịch phía dưới
trong
Dịch đục, bọt di chuyển rất
nhanh
Hình thức vi
bọt Cầu
Thời gian
phân lớp Vài giây 65 ± 5
(phút) 40 ± 5 (phút) 20 ± 4 (phút) Số lượng vi
bọt trên một vi trường
Không thấy
còn bọt 277 ± 22 24 ± 6 30 ± 5
Hình ảnh vi bọt trên tiêu bản
Không quan
sát Hình 3. PL Hình 8. PL Hình 9. PL Nhận xét: Khi sử dụng nước đá để làm nguội dịch sau tạo bọt thì bọt bị vỡ hết, không quan sát thấy trên kính hiển vi. Để nguội tự nhiên và sử dụng nước ở nhiệt độ 400C, số lượng bọt còn lại quan sát được trên vi trường cũng rất ít. Khi sử dụng nước ở 250C làm nguội thì số lượng bọt thu được là nhiều nhất và bền khi soi trên tiêu bản. Lựa chọn nước ở 250C để làm nguội dịch sau tạo bọt cho các khảo sát tiếp theo.
39