Alcalase
Sau khi đã trải qua nhiều thí nghiệm và phần nào xác định được các thơng số phù hợp cho quá trình thủy phân vỏ đầu tơm bằng enzyme Alcalase như sau:
pH 8,0
Tỷ lệ nước so với nguyên liệu: 1/1 (v/w) Tỷ lệ enzyme/nguyên liệu: 2/1000 Nhiệt độ phản ứng: 55oC
Thời gian thủy phân: 6÷8 giờ
Tuy nhiên, để đưa kết quả nghiên cứu này vào sản xuất trong thực tiễn thì chúng ta cần làm thế nào để chi phí sản xuất là tối thiểu nhưng vẫn đảm bảo sản phẩm tốt nhất, chất lượng cao nhất. Dựa trên tiêu chí đĩ nhận thấy rằng tại giá trị pH 8,0 và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 1/1 (v/w) là đã tối ưu với quá trình thủy phân vỏ đầu tơm. Cịn lại 3 thơng số: Tỷ lệ enzyme bổ sung, nhiệt độ phản ứng, thời gian thủy phân ảnh hưởng trực tiếp đến chi phí sản xuất và chất lượng sản phẩm. Vì vậy, làm thế nào để thời gian thủy phân tối thiểu, tỷ lệ enzyme bổ sung vừa phải và nhiệt độ phản ứng tối ưu nhất, đề tài tiến hành quy hoạch thực nghiệm phương án
trực giao cấp hai 3 yếu tố: Nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân, tỷ lệ enzyme bổ sung
Qua nhiều thí nghiệm bố trí theo phương pháp cổ điển ở trên, chúng tơi đã xác định được khoảng biến thiên phù hợp của các yếu tố như sau:
Nhiệt độ thủy phân (oC): X1 [40;60] Thời gian thủy phân (giờ): X2 [4;10] Tỷ lệ enzyme bổ sung (%):X3 [0,06;0,3]
Chỉ tiêu cần tối ưu ở đây là hàm lượng protein tách được so với ban đầu ký hiệu là Y (%). Mục tiêu tối ưu là Y đạt giá trị Max.
Theo quy hoạch thực nghiệm phương án trực giao cấp hai thì số thí nghiệm cần được tiến hành để đánh giá sự tác động của từng yếu tố:
N = 2k + 2k + n0
Trong đĩ: N là số thí nghiệm k là số yếu tố, k = 3
no là số thí nghiệm bổ sung thêm ở tâm phương án, no=1 Vậy N = 23 +2×3 +1 = 15
Từ các điều kiện biên của các yếu tố quy hoạch thực nghiệm, chúng tơi lập bảng về mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thực nghiệm bảng 3.3.
Bảng 3.3. Mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thí nghiệm
Mức thí nghiệm X1 (oC) X2 (giờ) X3 (%)
Mức cơ bản 50 7 0,18
Khoảng biến thiên 10 3 0,12
Mức trên (+) 60 10 0,3
Bảng 3.4. Ma trận trực giao cấp hai, ba yếu tố STT xo x1 x2 x3 x1 x2 x1 x3 x2 x3 x1’2 x2’2 x3’2 y 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +0,27 +0,27 +0,27 86,0 2 +1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +0,27 +0,27 +0,27 85,2 3 +1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +0,27 +0,27 +0,27 82,6 4 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +0,27 +0,27 +0,27 82,4 5 +1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 +0,27 +0,27 +0,27 83,9 6 +1 -1 +1 -1 -1 +1 -1 +0,27 +0,27 +0,27 79,5 7 +1 +1 -1 -1 -1 -1 +1 +0,27 +0,27 +0,27 81,5 8 +1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +0,27 +0,27 +0,27 80,4 9 +1 +1,215 0 0 0 0 0 +0,746 -0,73 -0,73 85,3 10 +1 -1,215 0 0 0 0 0 +0,746 -0,73 -0,73 79,2 11 +1 0 +1,215 0 0 0 0 -0,73 +0,746 -0,73 84,4 12 +1 0 -1,215 0 0 0 0 -0,73 +0,746 -0,73 81,8 13 +1 0 0 +1,215 0 0 0 -0,73 -0,73 +0,746 83,7 14 +1 0 0 -1,215 0 0 0 -0,73 -0,73 +0,746 80,6 15 +1 0 0 0 0 0 0 -0,73 -0,73 -0,73 84,8
Sau khi tính hệ số hồi quy và kiểm tra tính cĩ ý nghĩa của chúng theo tiêu chuẩn Student (chi tiết trình bày ở phụ lục 5) kết quả thể hiện trên bảng 3.5.
Bảng 3.5. Bảng kết quả kiểm tra mức ý nghĩa của các hệ số hồi quy
Hệ số hồi quy (b) Hệ số t So sánh với tp(f) = 4,3
bo= 82,8 t0 = 631,2 Lớn hơn b1= 1,27 t1= 8,28 Lớn hơn b2 = 1,0 t2 = 6,46 Lớn hơn b3= 1,34 t3 = 8,73 Lớn hơn b12= 0,49 t12 = 3,80 Nhỏ hơn b13= -0,56 t13= 4,40 Lớn hơn b23= 0,59 t23 = 4,60 Lớn hơn b11= -0,42 t11= 0,03 Nhỏ hơn b22= 0,15 t22 = 0,03 Nhỏ hơn b33= -0,49 t22 = 0,03 Nhỏ hơn
Từ kết quả bảng 3.5 cho thấy các hệ số b1, b2, b3, b13, b23, cĩ ý nghĩa. Vậy phương trình hồi quy cĩ dạng
y = 82,8 + 1,27 x1 + x2 + 1,33 x3 – 0,56 x1x3 + 0,58 x2x3 (*)
Phương trình hồi quy (*) tương thích với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher (chi tiết phụ lục 5)
Theo phương trình hồi quy (*) nhận thấy:
Hệ số b1 = 1,27 > 0: Trong vùng quy hoạch khi tăng nhiệt độ, hàm lượng protein tách được so với ban đầu tăng. Điều này là phù hợp vì khi tăng nhiệt độ, hoạt tính enzyme tăng dẫn đến tốc độ thủy phân phế liệu tơm tăng. Tuy nhiên, khơng nên tăng nhiệt độ lên trên 60oC vì nhiệt độ cao trên 60oC dễ làm biến tính enzyme dẫn đến hoạt tính protease giảm mạnh.
Hệ số b2 = 1 >0: Khi kéo dài thời gian thủy phân, mức độ thủy phân phế liệu tơm triệt để hơn, lượng protein tách ra khỏi nguyên liệu nhiều hơn. Nhưng thời gian
thủy phân khơng nên kéo dài quá 8 giờ vì tại thời điểm này các amino acid bị thủy phân chuyển thành sản phẩm cấp thấp khơng phù hợp cho mục đích thu hồi protein. Hệ số b3 = 1,33 > 0: Khi tăng tỷ lệ enzyme Alcalase so với phế liệu tơm, tốc độ thủy phân nhanh hơn, lượng protein tách được nhiều hơn. Kết quả này hồn tồn phù hợp với lý thuyết. Tuy nhiên, tỷ lệ enzyme Alcalase so với phế liệu tơm khơng nên tăng quá 0,3% vì tăng tỷ lệ enzyme lên trên mức 0,3% lượng protein tách ra chênh lệch khơng nhiều trong khi giá thành sản phẩm tăng theo, làm giảm hiệu quả kinh tế.
Như vậy, hàm lượng protein tách được phụ thuộc vào cả 3 yếu tố. Khi tăng tỷ lệ enzyme bổ sung, thời gian và nhiệt độ thì hàm lượng protein tách được tăng lên. Đồng thời cĩ sự tác động qua lại giữa tỷ lệ enzyme bổ sung, thời gian và nhiệt độ. Tuy nhiên, hàm lượng protein tách được sẽ khơng tăng mãi theo x1, x2, x3 vì hệ số b12, b11, b22, b33nhỏ hơn 0. Trong 3 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách protein thì yếu tố tỷ lệ enzyme cĩ ảnh hưởng mạnh nhất, tiếp theo là yếu tố nhiệt độ.
Từ phương trình (*) ta tiến hành tối ưu hĩa theo phương pháp lên dốc của Box – Wilson. Kết quả tối ưu được thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả tối ưu hĩa quá trình thủy phân phế liệu tơm bằng enzyme
Tên x1 x2 x3 y
Mức cơ sở 55 7 0,18
Hệ số bj 1,44 1,28 1,51
Khoảng biến thiên 10 4 0,12
bj ∆j 14,45 5,14 0,18 Bước δj 1,6 0,5 0,02 Bước làm trịn 2 0,5 0,02 Thí nghiệm 19 52 7,5 0,2 84,3 Thí nghiệm 20 54 8 0,22 86,3 Thí nghiệm 21 56 8,5 0,24 85,8 Thí nghiệm 22 58 9 0,26 85,0 Thí nghiệm 23 60 9,5 0,28 83,8
Từ bảng 3.6 rút ra nhận xét mẫu 20 cho kết quả tốt nhất, hàm lượng protein tách được là cao nhất, các mẫu sau cĩ kết quả thấp hơn.
Thơng số tối ưu cho quá trình thủy phân phế liệu tơm bằng enzyme Alcalase là: Nhiệt độ 54oC, thời gian thủy phân là 8 giờ, tỷ lệ enzyme bổ sung là 0,22; pH 8, tỷ lệ nước/ nguyên liệu là 1/1. Hàm lượng protein cịn lại trong chitin sau quá trình thủy phân bằng enzyme là 6%, tương ứng với 86,3% protein tách được so với ban đầu.
3.3. KẾT QUẢ LỰA CHỌN CHẾ ĐỘ THÍCH HỢP ĐỂ CHIẾT ASTAXANTHIN 3.3.1. Xác định mơi trường và thời gian thích hợp để chiết astaxanthin
Tiến hành chiết bằng dầu thực vật và petroleum ether thay đổi hiệu suất chiết theo thời gian được thể hiện ở phụ lục 6 và hình 3.5
0 10 20 30 40 50 1 2 3 4 5 6
Thời gian (giờ)
Hiệu su
ất thu h
ồi astaxanthin (m
g/kg)
dầu nành dầu phộng petroleum ether
Hình 3.5: Ảnh hưởng của mơi trường chiết và thời gian đến hiệu suất thu hồi astaxanthin
Cĩ thể thấy thời gian ngâm chiết là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu hồi astaxanthin. Khi tăng thời gian chiết 1÷3 giờ thì hiệu suất thu hồi astaxanthin tăng lên rõ rệt từ 36,2% đến 45,3%; 31,0% đến 38,8% tương ứng với dầu nành và dầu phộng, nhưng sau đĩ kéo dài thời gian 4÷6 giờ thì hiệu suất thu hồi astaxanthin giảm dần. Ở 6 giờ chiết bằng dầu nành đạt 25,0% và dầu phộng 21,3%. Riêng với
PE từ 1÷2 giờ hiệu suất chiết astaxanthin tăng từ 28,2% lên 33,2% sau đĩ ổn định và giảm dần. Điều này cĩ thể lý giải như sau: Trong khoảng thời gian đầu từ 1÷3 giờ, nồng độ astaxanthin trong mơi trường chiết cao, gradien nồng độ lớn nên tốc độ khuyếch tán astaxanthin vào dầu và PE lớn do đĩ hiệu suất thu hồi astaxanthin tăng nhanh. Qúa trình chiết được xem là quá trình khuyếch tán các chất tan, quá trình khuyếch tán tuân theo định luật Fick: “ Lượng chất khuyếch tán tỷ lệ thuận với diện tích bề mặt tiếp xúc giữ dung mơi và chất tan, với gradien nồng độ và thời gian khuyếch tán”. Hơn nữa astaxanthin bị giải phĩng một phần trong quá trình thủy phân do liên kết trong phức hợp chitin-calci carbonat bị phá vỡ. Khi thời gian chiết tiếp tục tăng lên, nồng độ astaxanthin trong mơi trường chiết giảm làm giảm gradien nồng độ, do đĩ làm giảm dần tốc độ khuyếch tán của astaxanthin vào trong dầu và PE. Trong khi đĩ, lượng dầu và PE ban đầu khơng đủ để ngăn cản sự oxy hĩa astaxanthin bởi oxy khơng khí khi kéo dài thời gian xử lý. Điều này hồn tồn phù hợp với nghiên cứu của Hoàng Thị Huệ An (2004) [1] cho rằng khi thời gian xử lý càng dài thì hiệu suất thu hồi astaxanthin càng giảm do sự phân hủy chuỗi polyen của phân tử astaxanthin bởi oxy khơng khí. Do đĩ, tác giả đề nghị nên tiến hành chiết astaxanthin ngay từ nguyên liệu ban đầu trước khi thu hồi chitin. Theo Synowiecki và Al-Khateeb (2001) [43] thời gian trích ly kéo dài hơn 30 phút thì khả năng chống oxy hĩa (ethoxyquyn) giảm, và nĩ thúc đẩy đáng kể sự phân hủy sắc tố.
Trong số các mẫu nghiên cứu, hiệu suất thu hồi astaxanthin cao nhất ở các mẫu ngâm chiết bằng dầu nành. Cụ thể khi ngâm chiết 3 giờ hiệu suất thu hồi astaxanthin đạt 45,3%, cao hơn so với dầu phộng và PE ở cùng một mốc thời gian. Tuy nhiên, để lựa chọn được dung mơi thích hợp cần cân nhắc đến hiệu quả kinh tế và vấn đề an tồn lao động. Trong các dung mơi đã được lựa chọn, dầu nành cho hiệu suất chiết cao nhất, kế đến là dầu phộng và kém nhất là petroleum ether, thêm vào đĩ nhiều nghiên cứu cho thấy dầu thực vật thường được sử dụng nhiều hơn do nĩ cĩ nhiều đặc tính ưu việt như: Cĩ khả năng bảo vệ astaxanthin chống lại quá trình oxy hĩa bởi các tác nhân oxy khơng khí, ánh sáng mặt trời, ngồi ra sau khi thu hồi nĩ cịn là một nguồn năng lượng bổ sung vào thức ăn chăn nuơi (Meyers và Bligh, 1891 [35]; Chen và Meyers, 1982, 1983 [22] [23]; Chen và cộng sự, 1985 [24]).
Qua nhiều thí nghiệm nghiên cứu, chúng tơi quyết định lựa chọn mơi trường chiết là dầu nành và thời gian chiết là 3 giờ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Xác định nhiệt độ thích hợp để chiết astaxanthin
Tiến hành chiết astaxanthin bằng dầu nành đã chọn được ở trên, sự thay đổi hiệu suất chiết theo nhiệt độ được thể hiện ở phụ lục 6 và hình 3.5.
0 10 20 30 40 50 30 40 50 60 70 80 Hiệu su ất thu hồi a staxanth in (%)
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi astaxanthin
Theo nhiệt độ ngâm chiết, hiệu suất thu hồi astaxanthin cĩ sự khác nhau rõ rệt. Khi tăng nhiệt độ lên 50oC thì hiệu suất chiết astaxanthin tăng nhanh từ 34,6% lên 46,1%, sau đĩ tiếp tục tăng nhiệt độ thì hiệu suất giảm dần và thấp nhất ở 80oC là 32,8%. Điều này chứng tỏ rằng khi tăng nhiệt độ lên thì hệ số khuyếch tán tăng, đồng thời khi nhiệt độ tăng làm cho độ nhớt giảm, qúa trình chuyển động nhiệt hỗn loạn của các phân tử tăng. Dẫn đến các phân tử astaxanthin khuyếch tán ra mơi trường dầu nhanh hơn và dễ dàng hơn, kết quả là hiệu suất chiết astaxanthin càng tăng. Khi đạt đến trạng thái cân bằng giữa hàm lượng astaxanthin trong vỏ tơm và trong dầu thì hiệu suất chiết sẽ đạt cực đại. Tại nhiệt độ 50oC cho hiệu suất thu hồi astaxanthin cao nhất là 46,1%. Sau đĩ hiệu suất chiết sẽ giảm khi tăng nhiệt độ lên 80oC do các phân tử astaxanthin bị phá hủy khi tiếp xúc ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên theo nghiên cứu của Synowiecki và Al-Khateeb (2001) [43] thì hiệu suất chiết astaxanthin bằng
dầu thực vật cĩ thể tăng khi chiết ở nhiệt độ cao (khoảng 90oC) nếu bổ sung thêm chất chống oxy hĩa để ngăn cản sự phân hủy sắc tố. Kết quả nghiên cứu của Chen và Meyers (1982) [22] kết luận nhiệt độ 80-90oC cho hiệu suất chiết astaxanthin cao nhất đối với dầu nành. Theo Sachindra và Mahendrakar (2004) [38] nhiệt độ 70oC là tối ưu cho việc trích ly astaxanthin từ phế liệu tơm bằng dầu hướng dương.
3.3.3. Xác định tỷ lệ dầu nành/nguyên liệu thích hợp để chiết astaxant hin
Bố trí thí nghiệm chiết astaxanthin với các tỷ lệ 1/1, 2/1, 3/1, 4/1, 5/1 (v/w) dựa trên nhiệt độ và thời gian thích hợp đã chọn để cĩ cơ sở tìm được chế độ chiết tốt nhất. Kết quả được trình bày ở phụ lục 6 và hình 3.7.
0 10 20 30 40 50 1/1 2/1 3/1 4/1 5/1
Tỷ lệ dầu nành/nguyên liệu (v/ w)
Hiệu su
ất thu hồi a
staxanth
in (%)
Hình 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ dầu nành so với nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi astaxanthin
Một điều rõ ràng nhận thấy ở đây là khi tăng tỷ lệ dầu/nguyên liệu thì hiệu suất thu hồi astaxanthin cũng tăng dần. Hiệu suất chiết astaxanthin tăng từ 32,9% ở tỷ lệ 1/1 lên 46,7% ở tỷ lệ 5/1. Thế nhưng hiệu suất thu hồi astaxanthin tăng lên nhanh nhất từ 32,9% lên 41,3% khi tăng tỷ lệ dầu nành/nguyên liệu từ 1/1 đến 2/1. Khi tiếp tục tăng tỷ lệ dầu nành/nguyên liệu cao hơn nữa thì hiệu suất thu hồi astaxanthin cũng tăng rất chậm và khơng đáng kể. Qúa trình này cũng được giải thích theo định luật Fick: “Khi tăng tỷ lệ dung mơi/nguyên liệu làm tăng gradien
nồng độ”. Cân nhắc giữa hiệu suất thu hồi astaxanthin và chi phí giá thành dầu nành, nên chọn tỷ lệ dầu nành/nguyên liệu thích hợp là 2/1 (v/w). Như vậy tỷ lệ dầu/nguyên liệu sử dụng trong đề tài cao hơn gấp 2 lần so với nghiên cứu của Chen và Meyers năm 1982 [22].
3.3.4. Tối ưu hĩa quá trình chiết astaxanthin
Qua thí nghiệm thăm dị miền biên và kế thừa các kết quả nghiên cứu đi trước, đề tài nghiên cứu quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp hai ba yếu tố, sau đĩ tối ưu hĩa quá trình bằng phương pháp đường dốc nhất để tìm giá trị tối ưu.
Khoảng biến thiên phù hợp của các yếu tố: - Tỷ lệ dầu/nguyên liệu (v/w): X1 [1/1;3/1] - Thời gian chiết (giờ): X2 [1;4]
- Nhiệt độ chiết (oC): X3 [40;60]
Chỉ tiêu cần tối ưu ở đây là hiệu suất chiết astaxanthin, ký hiệu là Y (%). Mục tiêu tối ưu là Y đạt giá trị Max.
Theo quy hoạch thực nghiệm phương án trực giao cấp hai thì số thí nghiệm cần được tiến hành để đánh giá sự tác động của từng yếu tố:
N = 2k + 2k + n0
Trong đĩ: N là số thí nghiệm
k là số yếu tố, ở đây là 3 yếu tố (k = 3)
no là số thí nghiệm bổ sung thêm ở tâm phương án, ở đây no=1 Vậy N = 23 +2×3 +1 = 15
Bảng 3.7. Mức thí nghiệm của các yếu tố
Mức thí nghiệm X1 (v/w) X2 (giờ) X3 (oC)
Mức cơ bản 2/1 2,5 50
Khoảng biến thiên 1/1 1,5 10
Mức trên (+) 3/1 4 60
Bảng 3.8. Ma trận trực giao cấp hai, ba yếu tố STT xo x1 x2 x3 x1 x2 x1 x3 x2 x3 x1’2 x2’2 x3’2 y 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +0,27 +0,27 +0,27 47,15