a. Phương pháp thu nhận protein
Phương pháp cơ học:
Nguyên lý: Sử dụng các lực cơ học để tách một phần protein ra khỏi nguyên liệu vỏ đầu tơm. Quá trình được tiến hành như sau: Đầu tơm cịn tươi đem rửa sạch, sau đĩ ép bằng trục lăn hoặc trục vít, thu protein đem sấy khơ và bảo quản. Hiệu quả thu hồi protein của phương pháp này khơng cao. Tuy nhiên, quá trình này đã loại bỏ một phần protein tự do trong đầu tơm vì vậy giảm thiểu được hĩa chất sử dụng cho các cơng đoạn tiếp theo.
Phương pháp hố học:
Một số cơng trình trên thế giới đã nghiên cứu khử protein của phế liệu giáp xác bằng NaOH. Phương pháp này mang lại một số ưu điểm như đơn giản, khơng địi hỏi thiết bị máy mĩc phức tạp, do dĩ rất dễ áp dụng để sản xuất lớn. Tuy nhiên, phương pháp này cĩ nhược điểm là dịch thải thường thải bỏ do nĩ cĩ chứa kiềm, protein và sản phẩm protein thủy phân. Hơn nữa, protein bị hạn chế sử dụng do các phản ứng khơng mong muốn xảy ra trong mơi trường kiềm mạnh [32].
Phương pháp sinh học:
Nguyên lý của phương pháp này dựa trên việc sử dụng hệ enzyme cĩ sẵn trong đầu tơm hoặc bổ sung enzyme nguồn gốc từ thực vật (papain, bromelain), động vật (đầu tơm, nội tạng cá thu, ngừ, mực ống…), vi sinh vật (protease từ nấm mốc và vi khuẩn) để thuỷ phân protein đầu tơm thành các phần peptid, amino acid và thu hồi chúng. Quá trình được tiến hành như sau: Đầu tơm Ép, nghiền
Thuỷ phân Phân ly Protein. Cĩ 2 phương pháp: Phương pháp bổ sung enzyme protease và phương pháp ủ xi lơ.
Phương pháp bổ sung enzyme protease: Thu hồi protein trên cơ sở dựa vào hoạt tính của protease cĩ sẵn trong phế liệu tơm và bổ sung từ bên ngồi vào. Phương pháp này cĩ ưu điểm là tận dụng được enzyme protease sẵn cĩ trong đầu tơm, rút ngắn được thời gian khi ta bổ sung protease với hàm lượng nhất định.
Thêm vào đĩ phương pháp bổ sung enzyme cịn cĩ thể lấy đi khoảng 90% protein
và carotenoid từ phế liệu tơm và làm tăng hàm lượng carotenoid khoảng 58% [44].
Đặc biệt khi dùng enzyme ta cĩ thể tận dụng tối đa giá trị của nguồn phế liệu và
hạn chế ảnh hưởng đến mơi trường. Mặt khác sản phẩm chitin thu được cĩ sự đồng nhất hơn về đặc tính lý hĩa.
Phương pháp ủ xi lơ: Phương pháp này lợi dụng hoạt động thuỷ phân protein
của protease để thu hồi protein. Tơm ủ xi lơ là thức ăn động vật dạng lỏng, đơi khi cịn gọi là protein lỏng. Sự hố lỏng của mơ tơm là kết quả của việc thuỷ phân protein nhờ hoạt động của enzyme, ngồi ra cịn được sự hỗ trợ bằng cách bổ sung các acid hữu cơ. Người ta cịn cho rằng phương pháp này cịn cĩ khả năng ổn định lượng astaxanthin trong bột tơm thu được. Chất lượng của protein thu được từ phương pháp này chủ yếu phụ thuộc vào hàm lượng các amino acid quan trọng trong đĩ.
Thơng thường acid formic với hàm lượng 3% được sử dụng làm tác nhân acid hố để hạ thấp pH xuống 4,0 hay thấp hơn nữa. Acid formic chứa một số thành phần cĩ tác dụng khử trùng, ức chế vi khuẩn và bảo quản phế liệu. Cĩ thể sử dụng hỗn hợp acid hữu cơ và vơ cơ như acid formic hoặc acid sulfuric, acid propionic… với các nồng độ khác nhau. Sau khi được trung hoà bởi một base thích hợp như NaOH, sản
phẩm ủ xi lơ cĩ thể sử dụng làm thức ăn động vật. Phương pháp đơn giản, khơng sử dụng máy mĩc thiết bị phức tạp nên dễ thực hiện.
Trong vài giờ đầu tiên của quá trình thuỷ phân, lượng amino acid thiết yếu tăng lên. Tuy nhiên, khơng nên kéo dài giai đoạn thuỷ phân vì khi đã đạt đến hiệu suất tối đa, tiếp tục thuỷ phân trong mơi trường acid sẽ làm giảm hiệu suất của các amino acid thiết yếu. Một thử nghiệm ở Canada sử dụng phế liệu tơm sấy khơ (Pandalus borealis) đã cho thấy hiệu suất tối đa của amino acid thiết yếu khi sử dụng acid HCl 5N trong 24 giờ.
Dịch thủy phân của cơng nghệ sản xuất chitin-chitosan theo phương pháp hĩa học và phương pháp sinh học cĩ thể thu hồi protein bằng cách dùng acid để
điều chỉnh pH dung dịch chứa protein về điểm đẳng điện của protein, sau đĩ dùng
các phương pháp lắng, lọc để thu hồi protein. Qúa trình được thực hiện như sau: Dịch protein → Kết tủa protein (dùng acid để điều chỉnh pH) → Lắng, gạn → Lọc thu dịch protein → Phơi, sấy → Bột protein.
Quá trình này cĩ ưu điểm là đơn giản, dễ làm, cĩ thể thu hồi với hiệu suất cao. Cho phép ta thu được hầu hết các protein hồ tan do đĩ cĩ thể ứng dụng để thu hồi protein trong nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm, chế biến thuỷ sản.
b. Phương pháp thu hồi astaxanthin
Astaxanthin là một hợp chất kém phân cực nên rất khĩ phân ly vào các chất lỏng phân cực như nước nhưng lại cĩ khả năng phân ly vào các chất lỏng kém phân cực như các dung mơi: Aceton, ethanol, diethyl ether, petroleum ether…và dầu thực vật[14]. Tính chất đặc trưng này là cơ sở để nghiên cứu dùng petroleum ether và dầu thực vật chiết astaxanthin cĩ trong phế liệu tơm.
Gần đây ở trường Đại học Nha Trang đã cĩ một vài thử nghiệm chiết xuất astaxanthin từ vỏ tơm, tuy đã thu được một số kết quả nhất định nhưng vẫn chưa cĩ tính khả thi để áp dụng vào thực tế sản xuất.
Theo kết quả nghiên cứu của Hoàng Thị Huệ An [1] gồm các cơng đoạn sau: Ngâm vỏ tơm trong cồn 96o (tỷ lệ 4/1; v/w) trong thời gian 4 ngày, sau đĩ tiếp tục chiết bằng petroleum ether (2/1; v/w) trong 4 ngày. Gộp tất cả dịch chiết
trên lại, thêm nước để chuyển astaxanthin sang dung mơi PE, rồi loại bỏ toàn bộ dung mơi PE bằng cách bay hơi chân khơng và đuổi bằng dịng khí N2, sẽ thu được sản phẩm astaxanthin cơ đặc.
1.2.2.3. Các nghiên cứu thu hồi chitin, protein và astaxanthin bằng phương pháp sử dụng enzyme
Theo phương pháp sinh học tại cơng đoạn khử protein khơng sử dụng hố chất mà cĩ thể sử dụng hệ vi khuẩn, nấm men hoặc các enzyme để loại bỏ protein một cách triệt để. Sản phẩm chitin, chitosan thu được cĩ chất lượng cao do khơng bị ảnh hưởng nhiều bởi hố chất [8]. Các cơng đoạn cơ bản của phương pháp này được thực hiện như sau: Nguyên liệu Khử protein (bổ sung protease hoặc vi sinh vật cĩ khả năng sinh protease) Khử khống Chitin. Phản ứng thuỷ phân protein tạo thành các peptid, amino acid hồ tan vào mơi trường.
Việc sử dụng phương pháp sinh học cũng gặp phải rất nhiều khĩ khăn như giá thành sản phẩm cĩ thể sẽ cao tuỳ thuộc vào loại enzyme sử dụng, việc loại bỏ hồn tồn protein cĩ thể đạt được bằng phương pháp hố học nhưng khơng thể đạt
được bằng phương pháp sinh học [30]. Vì vậy, người ta cĩ thể kết hợp hai phương
pháp này nhằm khắc phục những nhược điểm của từng phương pháp. Hiện nay, một trong những khĩ khăn trong phương pháp hố học để sản xuất chitin là thể tích chất thải cĩ chứa các chất ăn mịn, các chất lơ lửng khĩ xử lý quá lớn. Những chất này là do trong cơng đoạn khử khống và khử protein sinh ra. Chính vì vậy, cần thiết phải cĩ các biện pháp xứ lý trước khi thải ra mơi trường và điều này làm cho giá thành sản phẩm tăng lên. Quá trình sản xuất chitin bằng phương pháp hố học cĩ thể gây nên sự thuỷ phân polymer (Simpson và cộng sự,1994; Healy và cộng sự,1994), biến đổi tính chất vật lý (Gagne và Simpson,1993) và gây ơ nhiễm mơi trường (Allan và cộng sự,1978) [30]. Điều này là do khơng xác định được bản chất hoạt động của
H2N – CH – CO – NH – CH – R1 R2 protease H2O Polypeptide H2N – CH – COOH R1 + H2N – CH – CO – NH – CH – R2
hố chất cũng như sự khác nhau về hàm lượng chitin trong nguyên liệu. Ngược lại, trong phương pháp sinh học thì thể tích chất khơng lớn, protein sau quá trình thủy phân bằng enzyme cĩ thể được thu hồi làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia súc, gia cầm, các chất khác như lipid, các sắc tố cũng được thu hồi. Hơn nữa sẽ hạn chế được việc xử lý mơi trường.
Việc nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong quá trình sản xuất chitin - chitosan đã được biết đến từ lâu, nhưng nổi bật nhất vẫn là những nghiên cứu vào cuối những năm tám mươi và đầu những năm chín mươi trở lại đây.
Shimahara và cộng sự, 1984 [41] cơng bố việc khử protein phế liệu giáp xác với việc sử dụng protease sản xuất từ vi khuẩn như Pseudomonas maltophilia LC-102
Gagne và Simpson, 1993 [27] đầu tư ứng dụng chymotrypsin và papain để khử protein của phế liệu tơm. Nghiên cứu chỉ ra protein cịn lại trong phế liệu sau khi thủy phân là 1,3% và 2,8% tương ứng với các mẫu được xử lý bằng enzyme chymotrysin và papain.
Cĩ một vài nghiên cứu so sánh hiệu quả thủy phân protein giữa enzyme và vi khuẩn. Bustos và Michael, 1994 [21] tìm thấy Pseudomonas maltophilia khử được 82% protein sau 6 ngày thủy phân, cịn protease từ vi khuẩn thấp hơn 64% trong cùng điều kiện thủy phân.
Wang và Chio, 1998 [51] cơng bố việc khử protein phế liệu giáp xác bằng
Pseudomonas aeruginosa K-187. Sau 5 ngày thủy phân khử được 82% protein từ vỏ
và đầu tơm. Kết quả này cũng rất gần với 82% sau 6 ngày thủy phân bằng Pseudomonas
maltophilia ghi nhận bởi Bustos và Michael, 1994.
Shimahara và Takiuchi, 1998 [42] đã sử dụng P. matophilia vào việc thủy phân protein từ các mảnh vỏ đã tách khống và thấy rằng hàm lượng protein cịn lại 5% và 8% sau 8 ngày thủy phân.
Để hiểu thêm về khả năng khử protein của enzyme protease, Jen-Kuo Yang và cộng sự (1999) [52] sử dụng protease từ Bacillus subtilis ở nhiệt độ 50oC, pH 8,0 để khử protein từ vỏ tơm, vỏ ghẹ và vỏ tơm hùm trong cơng nghệ sản xuất chitosan. Kết quả đã loại bỏ được 88%, 67%, 83% protein theo thứ tự.
Synowiecki và cộng sự (2000) [43] nghiên cứu ứng dụng Alcalase để khử protein của phế liệu vỏ tơm Crangon crangon nhằm thu hồi chitin và protein. Ban đầu vỏ tơm Crangon crangon được khử khống sơ bộ bằng dung dịch HCl 10% ở 20oC trong 30 phút và khử protein bởi enzyme thương mại Alcalase ở 55oC và pH 8,5. Dịch thuỷ phân thu được chứa 63% protein so với vật chất khơ (Nx6,25), 6,24% lipi d, 23,4% NaCl. Hàm lượng protein cịn lại sau thủy phân khoảng 4% cĩ thể là do trong quá trình thủy phân cĩ sự kết hợp khử protein bằng NaO H 4M.
Nghiên cứu khác của Synowiecki và Al-Khateeb (2001) [44] cho rằng enzyme tốt nhất cho việc phân tách carotenoprotein là trypsin. Phương pháp enzyme lấy đi khoảng 90% protein và carotenoid từ phế liệu quá trình chế biến tơm. Protease nội tại thích ứng với nhiệt độ thấp rất hữu ích cho quá trình xử lý vỏ phế liệu giáp xác, phương pháp dựa trên việc kiểm sốt tự động sự phân giải protein. Sản phẩm thu
được cĩ chứa khoảng 4,5% carotenoid, đây cũng là nguồn hợp chất tốt để tạo màu
đẹp cho cá hồi và lịng đỏ trứng gà. Việc xử lý sơ bộ phế liệu giáp xác bằng enzyme protease thương mại cịn tăng hàm lượng carotenoid khoảng 58%.
Rupsankar Chakrabarti (2002) [47] cho biết khi trích ly carotenoprotein từ phế liệu tơm Metapenaeus monoceros bằng trysin cho hiệu suất thu hồi sắc tố carotenoid là cao nhất 55%, pepsin và papain là 50% trong 4 giờ ở nhiệt độ 28 ±5oC, hàm lượng protein trong bột protein là 450 g/kg.
Mizani và cộng sự (2005) [36] đã nghiên cứu thủy phân phế liệu đầu tơm
P. semisulcatus bằng enzyme thương mại Alcalase. Để cải thiện hiệu quả trích ly, một vài chất hĩa học như sodium sulphite và Triton x-100 được sử dụng kết hợp với enzyme. Khi Alcalase sử dụng độc lập (12 AU/kg), hiệu suất trích ly protein 45,1%, nhưng khi xử lý kết hợp với Triton x-100 (0,01 g/kg) thì hiệu suất thu hồi protein giảm xuống 39%, trong khi bổ sung sodium sulphite (200 mmol/lit) cùng với enzyme hay hỗn hợp enzyme và Triton x-100 tăng mức trích ly protein từ 62% và 65,1% tương ứng. Protein kết tủa tại pH 3,1 thì hàm lượng sulphite trong bột protein giảm 97% và bột protein thu được cĩ chứa đầy đủ amino acid thiết yếu thích hợp làm thức ăn chăn nuơi.
Holanda và Netto, 2006 [32] nghiên cứu thu hồi 3 thành phần chính của phế liệu tơm, protein, chitin, astaxanthin bằng việc sử dụng enzyme Alcalase và pancreatin. Theo tác giả trong phế liệu tơm Xiphopenaeus kroyeri cĩ chứa 39,42% protein, 31,98% tro, và 19,92% chitin. Tiến hành thủy phân khử protein bằng enzyme Alcalase tại các điều kiện: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (E/S) 3%, nhiệt độ 60oC, pH 8,5. Kết quả nhận thấy rằng Alcalase cĩ hiệu quả thu hồi protein, astaxantin, chitin cao hơn so với trypsin, chymotripsin và carboxypeptidase tăng hiệu quả thu hồi protein từ 57,5% lên 64,6% và asthaxantin từ 4,7 lên 5,7 mg/100g phế liệu khơ.
Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thủy, 2006 [11] nghiên cứu nuơi cấy trực tiếp vi khuẩn Bacillus subtilis để loại protein ra khỏi vỏ của phế liệu tơm. Sau 24 giờ phần trăm protein cịn lại trong phế liệu tơm so với mẫu chưa xử lý là 12,99%.
Bùi Văn Tú, 2006 [15] nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để tách protein từ vỏ tơm trong cơng nghệ sản xuất chitosan. Tác giả đã xác định được chế độ lên men tối ưu khi sử dụng hai chủng Lactobacillus plantarum và chủng lactic phân lập từ vỏ tơm là tỉ lệ vi khuẩn so với nguyên liệu là 15/100 (v/w), tỉ lệ rỉ đường/nguyên liệu là 15/100 (w/w), thời gian lên men là 8,0 ngày. Ở chế độ lên men tối ưu hàm lượng khống và protein khử được khi sử dụng hai chủng L. plantarum và chủng lactic phân lập từ vỏ tơm lần lượt là 41,2%, 40,0% và 60,1%, 61,0%.
Nhìn chung cơng nghệ sản xuất chitin-chitosan chưa đề cập nhiều đến vấn đề thu hồi protein, astaxanthin nên gây lãng phí rất lớn các hợp chất cĩ giá trị này. Đa số các quy trình sản xuất chitin-chitosan dùng base mạnh để khử protein dẫn đến protein thu hồi sau quá trình thường thải bỏ do cĩ nồng độ kiềm quá cao. Một số nghiên cứu đã đi vào hướng dùng enzyme protease thủy phân protein cho kết quả cao về khả năng thu hồi protein và chitin. Nhiều loại enzyme protease đã được sử dụng vào mục đích này. Tuy nhiên ở Việt Nam chưa cĩ cơng trình nào nghiên cứu sử dụng enzyme Alcalase cho mục đích thu hồi protein, asthaxanthin và chitin- chitosan từ phế liệu tơm. Do đĩ nghiên cứu dùng enzyme Alcalase cho cơng đoạn tách protein là cần thiết nhằm tăng hiệu quả kinh tế cho phế liệu tơm và gĩp phần giảm ơ nhiễm mơi trường.
1.3. BẢN CHẤT, CƠ CHẾ VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN [10] THỦY PHÂN [10]
Qúa trình thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị dương trong hợp chất hữu cơ thành các đơn phân dưới tác dụng của chất xúc tác cĩ sự tham gia của nước trong phản ứng.
Enzyme là chất xúc tác mang bản chất protein, enzyme cĩ khả năng tương tác lên các liên kết nhị dương và làm thay đổi các liên kết thủy phân trong phân tử cơ chất, làm cho các liên kết này bị suy yếu và dễ dàng bị đứt ra khi cĩ yếu tố nước tham gia.
Cơ sở lý thuyết về tác dụng của enzyme thủy phân vào liên kết nhị dương
Đa số enzyme thủy phân (hydrolase) khơng cĩ nhĩm ngoại. Trong trung tâm hoạt động của chúng cĩ chứa gốc amino acid đặc hiệu. Đối với hydrolase thường chứa hai nhĩm chức.
Ví dụ: + Vịng imidazol của histidin
+ Nhĩm hydroxyl (một số amino acid: serine, threonine)
Sự tương tác giữa hai nhĩm đặc hiệu (-OH, - imidazol) đã hình thành tâm ái nhân. Xung quanh trung tâm hoạt động của hydrolase cịn chứa nhiều các amino acid, vai trị của serine cĩ chứa nhĩm – OH cĩ tác động rất lớn làm thay đổi trung tâm hoạt động theo hướng cĩ lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme. Do cấu trúc bậc 3 của phân tử protein-enzyme mà nhĩm hydroxyl của serine và vịng imidazol của histidin gần gũi nhau, tạo ra liên kết hydroxyl giữa gốc – OH của serine với nitơ