Nguyên liệu đầu vỏ tơm được thu tại phân xưởng chế biến, Cơng ty Cổ phần Nha Trang SeaFoods (F17). Yêu cầu nguyên liệu phải tươi, khơng cĩ mùi lạ, khơng bị biến đỏ, khơng lẫn tạp chất. Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt cĩ chứa nước đá và vận chuyển về phịng thí nghiệm. Sau đĩ rửa sạch và xay nhuyễn (trong đĩ cĩ 50% là vỏ tơm và 50% là đầu tơm, tất cả các mẫu thí nghiệm đều được xay bởi cùng một thiết bị và kích thước mẫu sau khi xay là 0,3÷0,8 cm) và tiến hành làm thí nghiệm ngay. Trong trường hợp chưa làm ngay thì rửa sạch, cân cho vào túi nylon (mỗi túi 1 kg), bảo quản đơng ở điều kiện nhiệt độ -20oC .
2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thơng số quy trình
Vỏ đầu tơm
Xay nhỏ
Tách protein bằng enzyme Alcalase Nhiệt độ, thời gian, tỷ
lệ E/S, pH Bã Dịch lọc: thu hồi protein Chiết astaxanthin Lọc, rửa Bã đã chiết astaxanthin Khử protein Khử khốmg Chitin Deacetyl hĩa Chitosan
Mơ tả quy trình
Nguyên liệu vỏ đầu tơm được xay nghiền kích thước 0,3÷0,8 cm và tách protein bằng enzyme Alcalase để chọn ra thời gian, pH, tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, nhiệt độ thích hợp. Sau khi tìm được chế độ tối ưu ta tiến hành thuỷ phân rồi lọc tách riêng phần dịch và phần bã. Phần dịch tận dụng thu protein, phần bã được rửa sạch, chiết astaxanthin bằng petroleum ether, dầu nành, dầu phộng để chọn ra mơi trường và điều kiện chiết thích hợp. Bã sau khi chiết astaxanthin đem đi khử protein bằng NaOH và khử khống bằng HCl thu được chitin và deacetyl bằng NaOH đặc thu được chitosan.
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình tách protein đầu vỏ tơm bằng enzyme Alcalase
Để cĩ thể tìm được các điều kiện thích hợp cho quá trình tách protein khỏi phế liệu tơm khi sử dụng enzyme Alcalase, các thí nghiệm được tiến hành như sau:
Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Alcalase so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân
Bước đầu chúng tơi cố định các thơng số:
- Chọn nhiệt độ thủy phân 55oC
- Thời gian thủy phân 8 giờ
- pH 8,5
- Tỷ lệ nước/nguyên liệu 1/1 (v/w)
Tiến hành thủy phân phế liệu tơm bằng enzyme Alcalase với tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau: 1/3000, 1/1500, 1/1000, 2/1500, 2/1000, 3/1000 (v/w), mỗi mẫu 200g. Sau 8 giờ dừng phản ứng thủy phân bằng cách nâng nhiệt lên 90oC trong 5 phút. Rửa sạch và đem xác định hàm lượng protein cịn lại trong mẫu. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Xác định ảnh hưởng của pH tới quá trình thủy phân
Để xác định giá trị pH thích hợp cho quá trình thủy phân, tiến hành 6 mẫu thí nghiệm (mỗi mẫu 200g phế liệu tơm đã xay nhỏ) thủy phân bằng enzyme Alcalase với tỷ lệ thích hợp đã lựa chọn ở trên, nhiệt độ 55oC, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1, thời gian thủy phân 8 giờ. Dùng NaOH 1N để điều chỉnh pH về các giá trị pH 7,0; pH 7,5; pH 8,0; pH 8,5; pH 9,0 và pH 9,5. Sau đĩ dừng phản ứng bằng cách nâng nhiệt lên 90oC trong 5 phút. Rửa sạch, lấy mẫu phân tích để chọn pH thích hợp. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
pH: 8,5
Nhiệt độ: 55oC Thời gian: 8 giờ
Tỷ lệ nước/nguyên liệu: 1/1 Vỏ đầu tơm, xay nhỏ
1/3000 1/1500 1/1000 2/1500 3/1000
Xác định hàm lượng protein còn lại trong mẫu
Chọn tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp Thủy phân bằng Alcalase ở
các tỷ lệ khác nhau (v/w)
Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
Tiến hành các mẫu thủy phân (mỗi mẫu 200g phế liệu tơm) với các thơng số cố định: Tỷ lệ E/S và pH thích hợp, thơng số nhiệt độ thay đổi ở 30oC, 40oC, 45oC, 50oC, 55oC, 60oC, 65oC, 70oC. Dừng phản ứng ở thời gian 8 giờ. Lấy mẫu phân tích để chọn nhiệt độ thích hợp. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
Tỷ lệ E/S thích hợp Nhiệt độ: 55oC Thời gian: 8 giờ
Tỷ lệ nước/nguyên liệu: 1/1 Vỏ đầu tơm, xay nhỏ
7,0 7,5 8,0 8,5
Xác định hàm lượng protein còn lại trong mẫu
Chọn giá trị pH thích hợp Thủy phân bằng Alcalase ở
các pH khác nhau
9,5 9,0
Vỏ đầu tơm, xay nhỏ
30 45 50 55 60 70
Xác định hàm lượng protein cịn lại trong mẫu
Chọn nhiệt độ thích hợp Thủy phân bằng Alcalase ở
nhiệt độ khác nhau (oC)
Tỷ lệ E/S thích hợp pH thích hợp Thời gian 8 giờ
Tỷ lệ nước/nguyên liệu: 1/1
Xác định ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Xác định thời gian thủy phân thích hợp cho phản ứng giữa enzyme và phế liệu tơm bằng cách cho enzyme Alcalase vào phế liệu tơm đã xay nhỏ, điều chỉnh về giá trị pH thích hợp, tỷ lệ E/S, nhiệt độ thích hợp đã chọn được ở trên, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1, các mẫu đều chứa 200 g phế liệu tơm. Thủy phân ở các thời gian khác nhau: 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, và 14 giờ. Sau đĩ dừng phản ứng bằng cách nâng nhiệt lên 90oC trong 5 phút, mẫu thí nghiệm được rửa sạch và đem xác định hàm lượng protein cịn lại trong mẫu.
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định chế độ chiết astaxanthin từ phế liệu tơm
Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết astaxanthin
Dựa vào các thí nghiệm thăm dị và các dẫn liệu khoa học của Hoàng Thị Huệ An (2004) [1], Chen và Meyers (1982) [22] cho phép chọn mơi trường chiết là dầu nành, dầu phộng và petroleum ether đồng thời cố định thơng số nhiệt độ 50oC, tỷ lệ dầu/nguyên liệu là 2/1(v/w) đối với dầu nành, dầu phộng và 40oC, tỷ lệ 5/1 (v/w) đối với petroleum ether. Sau các khoảng thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ lấy mẫu xác định hàm lượng astaxanthin để chọn thời gian thích hợp. Sơ đồ bố trí như sau:
Vỏ đầu tơm, xay nhỏ
2 6 8 10 12 14
Xác định hàm lượng protein cịn lại trong mẫu
Chọn thời gian thích hợp Thủy phân ở các khoảng thời gian khác nhau (giờ)
Tỷ lệ E/S thích hợp pH thích hợp Nhiệt độ thích hợp
Tỷ lệ nước/nguyên liệu: 1/1
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết astaxanthin
Tiến hành chiết astaxanthin ở các khoảng nhiệt độ 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC với tỷ lệ dung mơi/nguyên liệu 2/1 (v/w). Sau khoảng thời gian chiết thích hợp lấy mẫu xác định hàm lượng astaxanthin để chọn nhiệt độ thích hợp. Sơ đồ bố trí như sau:
Thời gian (giờ)
Lọc, ly tâm 3000 vịng/20 phút
Thu dịch chứa astaxanthin
Xác định hàm lượng astaxanthin
Chọn thời gian thích hợp Xử lý tách astaxanthin
Petroleum ether Dầu nành Dầu phộng
6
2 3 4
1 5
Ảnh hưởng của tỷ lệ dung mơi/nguyên liệu đến quá trình chiết astaxanthin
Tiến hành chiết astaxanthin với tỷ lệ dung mơi/nguyên liệu là 1/1, 2/1, 3/1, 4/1, 5/1 (v/w), nhiệt độ và thời gian đã lựa chọn ở trên. Sơ đồ bố trí như sau:
Bã đã tách protein
Xử lý tách astaxanthin
Dung mơi thích hợp
Lọc, ly tâm 3000 vịng/20 phút
Thu dịch chứa astaxanthin
Xác định hàm lượng astaxanthin
Chọn nhiệt độ thích hợp Nhiệt độ (oC)
40 50 60 70
2.2.5. Các phương pháp phân tích
Xác định hoạt độ của enzyme Alcalase theo phương pháp Anson
Nguyên tắc của phương pháp là dùng protein casein làm cơ chất xác định hoạt độ thủy phân protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteau. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để định lượng tương ứng với lượng sản phẩm tạo thành dưới tác dụng của enzyme. 2/1 3/1 4/1 1/1 5/1 Bã đã tách protein Xử lý tách astaxanthin Dung mơi thích hợp
Tỷ lệ dung mơi/nguyên liệu (v/w)
Lọc, ly tâm 3000 vịng/20 phút
Thu dịch chứa astaxanthin
Xác định hàm lượng astaxanthin
Xác định hàm lượng astaxanthin tổng số theo phương pháp Kelly- Harmon
Xác định chất lượng sản phẩm bột carotenoprotein theo phương pháp cảm quan
Dùng mẫu đối chứng là chế phẩm bột carotenoprotein do Thái Lan sản xuất để xây dựng thang điểm cảm quan về màu sắc và mùi của chế phẩm bột thu được.
Bảng 2.1. Tiêu chuẩn màu sắc cho bột carotenoprotein do Thái Lan sản xuất
STT Màu sắc Ký hiệu
1 Nâu đỏ đậm +++++
2 Nâu đỏ hơi nhạt ++++
3 Đỏ cam nhạt +++
4 Màu cam, hơi ngả vàng nâu ++
5 Màu vàng nâu +
Bảng 2.2. Tiêu chuẩn mùi cho bột carotenoprotein do Thái Lan sản xuất
Xác định hàm lượng protein (Synowiecki và cộng sự, 2000)
Hàm lượng protein trong đầu tơm và chitin thơ được xác định (lặp lại 3 lần) bằng cách chiết rút (2-3g) mẫu với tỉ lệ mẫu/dung dịch NaOH 4% là 10/100 (w/v) trong 2 giờ ở 90oC. Tách phần vật chất khơng hoà tan bằng máy hút chân khơng và định mức đến 100 ml bằng nước cất. Lấy 5-10 ml dung dịch trên để xác định protein theo ph ương pháp Kjeldahl [42].
Mùi Điểm
Khơng cĩ mùi tanh 5
Mùi tanh rất nhẹ 4
Mùi tanh nhẹ 3
Mùi tanh 2
Nitơ tổng số được tính theo cơng thức : V F V V NTS 1000 0014 , 0 2 1 (g/l) Trong đĩ : V1 – số ml H2SO4 0,1 N cho vào cốc hứng V2 - số ml NaOH 0,1 N dùng để chuẩn độ
0,0014 - số g Nitơ tương đương với 1 ml H2SO4 0,1 N 1000 – hệ số tính ra g/l
F – độ pha loãng
V- số ml mẫu dùng để phân tích
Hàm lượng protein thơ (Pthơ)
Pthơ = NTS × 6,25 (%)
6,25 – là hệ số chuyển Nitơ tổng số ra protein thơ
Cơng thức tính % protein tách được so với ban đầu (Kyung-Taek Oh và cộng sự, 2007) O P R P O P DP O R O (%) x 100 Trong đĩ :
PO và PR là hàm lượng protein (g/g) trước và sau quá trình tách protein O và R là khối lượng mẫu trước và sau khi tách protein (g)
Xác định hàm lượng khống tổng số bằng phương pháp nung ở nhiệt độ 500 – 600oC.
Xác định hàm lượng ẩm theo phương pháp sấy khơ đến khối lượng khơng đổi ở 105oC.
Xác định màu sắc, độ mềm mại chitin, chitosa n theo phương pháp cảm quan.
Xác định độ nhớt được thực hiện trên thiết bị NDJ-1 ROTATIONAL VISCOMETER.
Xác định độ hịa tan (Trần Thị Luyến, 2004).
Xác định độ đục: Sử dụng máy đo độ đục “Direct Reading Spectrophotometer” ở bước sĩng 750 nm.
Xác định thành phần các amino acid bằng phương pháp sắc ký khí
(GC).
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu.
Phương pháp xác định độ tin cậy của số liệu thực nghiệm [5]
Khoảng tin cậy của kết quả thực nghiệm với độ tin cậy được xác định như sau: n S t x x /2 Trong đĩ:
x: giá trị kỳ vọng tốn học của đại lượng x
t/2: giá trị thu được từ bảng phân phối Students với (n-1) bậc tự do ứng với mức ý nghĩa = 1-
S: độ lệch chuẩn tính theo cơng thức
1 ) ( 1 2 n x x S n i i
Phương pháp tối ưu hĩa theo quy hoạch thực nghiệm [3], kết quả tối ưu hĩa
xử lý trên phần mềm Excel 2003.
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học. Mỗi thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA PHẾ LIỆU TƠM THẺ
Thành phần hố học của phế liệu tơm khơng ổn định mà cĩ thể thay đổi theo giống, lồi, giai đoạn sinh trưởng và mùa vụ… Do đĩ, để đánh giá được chất lượng và hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin, cần xác định chính xác thành phần hố học cơ bản của vỏ đầu tơm dùng làm đối tượng nghiên cứu. Kết quả phân tích thể hiện trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần hĩa học cơ bản của phế liệu tơm Thẻ chân trắng
Protein (%) Tro (%) Chitin (%) Astaxanthin (mg/kg)
45,3 28,5 19,2 267
(Tính theo vật chất khơ)
Kết quả phân tích cho thấy, ở phế liệu tơm Thẻ chân trắng cĩ hàm lượng protein thơ cao (45,3% theo trọng lượng khơ). Hàm lượng asthaxanthin trong mẫu nghiên cứu tuy khơng cao (267 mg/kg), nhưng cĩ giá trị kinh tế lớn và cĩ vai trị quan trọng trong thành phần thức ăn chăn nuơi. Như vậy, vỏ đầu tơm Thẻ chân trắng rất thích hợp cho việc nghiên cứu thu hồi protein, astaxanthin và chitin.
3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ BÊN NGỒI ĐẾN QUÁ TRÌNH TÁCH PROTEIN PROTEIN
3.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase/nguyên liệu
Tiến hành 7 mẫu thủy phân bằng Alcalase với tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau: 0; 1/3000; 1/1500; 1/1000; 2/1500; 2/1000, 3/1000 (v/w) so với nguyên liệu. Trong đĩ mẫu 1: khơng bổ sung enzyme, mẫu 2: bổ sung 1/3000, mẫu 3: bổ sung 1/1500, mẫu 4: bổ sung 1/1000, mẫu 5: bổ sung 2/1500, mẫu 6: bổ sung 2/1000, mẫu 7: bổ sung 3/1000. Tất cả các mẫu thủy phân đều tiến hành ở nhiệt độ 55oC, pH 8,5 với tỷ lệ nước so với nguyên liệu là 1/1 (v/w), mỗi mẫu thủy phân đều chứa 200 g vỏ đầu tơm. Sau 8 giờ lấy mẫu phân tích hàm lượng protein. Kết quả được thể hiện ở phụ lục 5 và hình 3.1.
65 70 75 80 85 90 0 1/3000 1/1500 1/1000 2/1500 2/1000 3/1000 Tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (v/w) Protein tách đư ợc so với ban đầu (% )
Hình 3.1. Biểu đồ biểu thị khả năng tách protein của enzyme Alcalase phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (v/w)
Các dẫn liệu khoa học đều khẳng định: Trong phản ứng thủy phân do enzyme xúc tác, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, pH, nhiệt độ, thời gian…Trong đĩ tỷ lệ enzyme/nguyên liệu cĩ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ phản ứng. Khi tỷ lệ enzyme/nguyên liệu càng tăng thì phản ứng thuỷ phân cắt đứt liên kết trong phân tử protein xảy ra càng mạnh. Các phân tử protein bị thuỷ phân thành các thành phần như polypeptid, peptid, amino acid…hồ tan vào dung dịch.
Từ kết quả thí nghiệm cho thấy khi tăng tỷ lệ enzyme bổ sung vào phế liệu tơm trong khoảng từ 1/3000÷3/1000 thì hiệu suất thủy phân protein tăng lên rõ rệt. Ban đầu khi chưa bổ sung thêm enzyme bên ngồi vào thì quá trình thủy phân protein vẫn diễn ra dưới tác dụng của hệ protease nội tại. Cụ thể, ở mẫu đối chứng hàm lượng protein tách được sau 8 giờ là 73,6%. Khi càng tăng tỷ lệ enzyme thì hàm lượng protein tách được càng nhiều do lúc này enzyme tương tác lên các liên kết nhị dương và làm thay đổi các liên kết thủy phân trong phân tử cơ chất, làm cho các liên kết này bị suy yếu và dễ dàng cắt mạch chuỗi peptid triệt để hơn, hình thành nhiều phân tử
nhỏ hơn. Theo Alder – Nissen, các nhĩm amino tự do (- NH2) hình thành trong quá trình thủy phân cĩ thể phản ứng trực tiếp với protein để thủy phân các liên kết peptid. Phản ứng này cũng được xem như sự vận chuyển các peptid sinh ra anion R-COO- và cation R-NH3+. Vì vậy các amino tự do cùng hỗ trợ cho sự cắt mạch protein [18]. Ở tỷ lệ 3/1000 hàm lượng protein tách được là 85,2% so với ban đầu và cao hơn so với mẫu đối chứng là 12% ở cùng điều kiện thủy phân. Tại tỷ lệ 3/1000 cho hiệu suất tách protein cao nhất là 85,2% nhưng so với hiệu suất tách protein ở tỷ lệ 2/1000 là 84,6% khơng cao hơn nhiều. Trong khi đĩ enzyme Alcalase lại cĩ giá thành rất đắt từ đĩ kéo theo giá thành sản phẩm đắt theo. Do đĩ tỷ lệ enzyme/nguyên liệu 3/1000 là khơng khả quan, nên chọn tỷ lệ enzyme/nguyên liệu 2/1000 là thích hợp nhất. Kết quả nghiên cứu cho thấy mặc dù dùng nồng độ enzyme thấp hơn 15 lần so với nghiên cứu của Holanda và Netto (2006) [32] nhưng hàm lượng protein cịn lại sau quá trình thủy phân thấp hơn 7% so với 9,06%. Nhưng theo nghiên cứu của Synowiecki và Al-