Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.7 Quy trình nghiên cứu
- Ghi nhận thông tin cá nhân.
Tuổi thật của các cá thể được tính bằng cách lấy ngày nhổ trừ cho ngày tháng năm sinh, tổng số ngày giữa hai thời điểm sẽ được chuyển thành tuổi tính theo năm với 1 chữ số thập phân đối với nhóm ước lượng tuổi dựa vào Asp ngà răng (nhóm AAR) và làm tròn đối với nhóm ước lượng tuổi dựa vào sự tăng trưởng xê măng chân răng (nhóm TCA).
- Đánh mã số răng.
- Các mẫu răng được phân loại theo bảy nhóm tuổi (dưới 20, từ 20-dưới 30, 30 đến dưới 40, 40 đến dưới 50, 50 đến dưới 60, 60-dưới 70 và từ 70 tuổi trở lên).
Ở mỗi nhóm tuổi, các răng được chia ngẫu nhiên vào 2 nhóm:
o Nhóm 1 (nhóm AAR): Gồm 80 răng dùng để thực hiện phương pháp ước lượng tuổi dựa vào thành phần Asp ngà răng.
Chọn thêm 8 răng (tương đương 10% mẫu nghiên cứu) ngoài mẫu nghiên cứu đưa vào nhóm kiểm chứng.
o Nhóm 2 (nhóm TCA): Gồm 80 răng dùng để thực hiện phương pháp ước lượng tuổi dựa vào sự tăng trưởng xê măng chân răng.
2.7.2 Xử lý mẫu
2.7.2.1 Nhóm ước lượng tuổi dựa vào thành phần Asp ngà răng (nhóm AAR) - Răng được ngâm 8 giờ trong dung dịch sodium hypochlorite 12% theo hướng
dẫn của Waite và cs [90], mục đích khử trùng và loại bỏ mô mềm bám dính.
- Rửa kỹ dưới vòi nước để làm sạch hóa chất.
- Mỗi mẫu răng được cắt dọc theo chiều ngoài – trong thành lát dày 1mm (lấy lát ở giữa răng) bằng đĩa cắt kim cương.
- Mài bỏ lớp men và xê măng bằng mũi khoan kim cương.
(a) (b) (c) (d)
Cả 2 giai đoạn đều có nước tưới để tránh nhiệt độ ảnh hưởng đến phản ứng triệt quang của Asp.
(Hình 2-8, 2-9, 2-10)
Hình 2-8 Các giai đoạn lấy mẫu ngà răng
(a) (b) Mẫu răng được cắt dọc theo chiều ngoài – trong thành lát dày 1mm (lấy lát ở giữa răng) bằng đĩa cắt kim cương.
(c) (d) Mài bỏ lớp men và xê măng bằng mũi khoan kim cương.
(A) (B)
Hình 2-9 Dụng cụ lấy mẫu ngà răng
(A) Đĩa cắt kim cương (B) Mũi khoan kim cương
(A) (B) Hình 2-10 Mẫu răng nhóm AAR (A) Răng được ngâm trong dung dịch
sodium hypochlorite 12%
(B) Mẫu ngà răng trước khi đưa vào quy trình HPLC
Sau đó, phần ngà răng được nghiền thành bột, lấy 10mg và xử lý theo quy trình của phương pháp sắc ký HPLC tại Phòng Phân tích trung tâm, Đại học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh như sau:
Hóa Chất:
- Chuẩn D và L- Aspartic acid, Ortho-Phathalaldehyde (OPA) (Sigma-Aldrich).
- Các muối Na2B4O7.10H2O, CH3COOH, NaOH, HCl (Merck).
- MeOH loại tinh khiết HPLC (Schalaur).
- Nước cất hai lần được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm.
Quy trình xử lý mẫu:
- Mẫu răng được làm sạch bằng siêu âm với nước cất hai lần.
- Thủy phân trong acid HCl 6 M trong 6 tiếng tại 1000C.
- Dịch thủy phân sau đó được làm khô dưới dòng khí N2 và hòa tan dịch cặn bằng 1 ml nước cất.
- Mẫu sau xử lý được tạo dẫn xuất với OPA trong hệ đệm Borat 0,4M, sau 2 phút, đưa dung dịch vào máy HPLC.
Chương trình HPLC:
- Pha động chạy đẳng dòng với thành phần gồm có 92 % đệm acetat pH 5,7 và 8% MeOH tại tốc độ dòng 1 mL/phút.
- Lò cột được ổn nhiệt tại 400C.
Biểu đồ 2-1 Kết quả phân tích HPLC
2.7.2.2 Nhóm ước lượng tuổi dựa vào sự tăng trưởng xê măng chân răng (nhóm TCA)
- Răng được cố định trong formol trung tính 10% (Hình 2-11).
- Mỗi mẫu răng được khử khoáng, cắt lát ngang khoảng 1/3 giữa chân răng, làm tiêu bản, nhuộm HE và quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần (Hình 2-12).
- Hình ảnh trên kính hiển vi được chuyển vào máy tính, các kích thước được đo bằng công cụ Measure của phần mềm Photoshop phiên bản CS2.
- Mỗi tiêu bản được đo 3 lần, lấy trung bình.
- Tất cả các tiêu bản răng được phân tích bởi cùng một người quan sát.
- Người quan sát đã được một Bác sĩ Giải phẫu bệnh Răng Hàm Mặt huấn luyện định chuẩn.
o Đánh giá sự nhất trí giữa người nghiên cứu và người huấn luyện:
- Chọn 10 tiêu bản.
- Người nghiên cứu ghi nhận các số vòng xê măng theo phương pháp đã được tập huấn.
- Sau đó kết quả được kiểm tra lại bởi người huấn luyện.
- Kết quả cho thấy có sự thống nhất giữa người nghiên cứu và người huấn luyện (Hệ số nội tương quan ICC = 0,98).
o Đánh giá sự kiên định của người nghiên cứu:
- Chọn ngẫu nhiên 10 tiêu bản và ghi nhận số vòng xê măng. Các tiêu bản được đánh giá lại sau 4 tuần.
- Kết quả cho thấy có sự thống nhất giữa hai lần đo (Hệ số nội tương quan ICC = 0,99).
Hình 2-11 Mẫu răng nhóm TCA được ngâm trong dung dịch formol trung tính 10%
Hình 2-12 Cách lấy mẫu răng để làm tiêu bản quan sát TCA
2.7.2 Ước lượng tuổi
2.7.2.1 Ước lượng tuổi nhóm dựa trên thành phần Asp ngà răng (nhóm AAR) - Tính tỷ lệ D/L của Asp trên từng mẫu ngà răng.
- Tính tuổi ước lượng theo công thức của Ohtani (2003) cho răng cối nhỏ thứ nhất [62]:
Y= 782,58 – 23,79 (1+ D/L) (1- D/L)
ln
- So sánh tuổi ước lượng và tuổi thật của bệnh nhân, nếu có sự khác biệt giữa tuổi ước lượng và tuổi thật, sẽ xây dựng phương trình hồi quy theo thành phần Asp của răng cối nhỏ thứ nhất để ước lượng tuổi.
- So sánh tuổi ước lượng theo phương trình hồi quy mới thiết lập với tuổi thật:
o Sai lệch so với tuổi thật = tuổi ước lượng – tuổi thật.
o Sai lệch tuyệt đối so với tuổi thật = Giá trị tuyệt đối của (tuổi ước lượng – tuổi thật).
- Mẫu kiểm chứng (ngoài mẫu nghiên cứu) dùng kiểm chứng lại phương trình hồi quy mới xây dựng:
o Gồm 8 răng cối nhỏ thứ nhất (10% mẫu nghiên cứu), xử lý theo đúng tiến trình nghiên cứu để tính tuổi ước lượng theo phương trình hồi quy mới được xây dựng, so sánh với tuổi thật.
o Kết quả của mẫu kiểm chứng không đưa vào nghiên cứu chính.
2.7.2.2 Ước lượng tuổi nhóm dựa vào sự tăng trưởng xê măng chân răng (nhóm TCA)
- Số lượng các vòng xê măng (TCA) được tính theo Aggarwal và cs (2008), Gupta và cs (2013) [6] [32].
o Chiều dày lớp xê măng (X) được đo nơi bề mặt xê măng song song với đường nối men xê măng (hình 2-13).
o Chiều dày giữa 2 vòng xê măng gần nhau (chọn vị trí rõ nhất) (Y) (Hình 2-14).
o Số vòng xê măng (n) =X/Y.
- Tuổi ước lượng = Tuổi răng mọc + số vòng xê măng.
o Tuổi răng cối nhỏ thứ nhất mọc được tính ở 2 thời điểm 10 tuổi và 11 tuổi theo ADA (2006) [8].
o Nếu chọn thời điểm 10 tuổi răng cối nhỏ mọc, tuổi ước lượng là số vòng xê măng + 10 (TCA+10).
o Nếu chọn thời điểm 11 tuổi răng cối nhỏ mọc, tuổi ước lượng là số vòng xê măng + 11 (TCA+11).
- So sánh tuổi ước lượng theo TCA với tuổi thật.
o Sai lệch so với tuổi thật = tuổi ước lượng – tuổi thật.
o Sai lệch tuyệt đối so với tuổi thật = Giá trị tuyệt đối của (tuổi ước lượng – tuổi thật).
Hình 2-13 Độ dày của toàn bộ lớp xê măng
(Nguồn: Gupta và cs (2014) [32]) X
Hình 2-14 Độ dày giữa 2 lớp xê măng
(Nguồn: Gupta và cs (2014) [32])