CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH DẠI
Chẩn đoán bệnh dại chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng và hoàn cảnh bị động vật cắn. Chẩn đoán xét nghiệm ít được dùng. Tuy nhiên, chúng được sử dụng trong những trường hợp đặc biệt (điều tra dịch tễ học và các đặc điểm sinh học của type gây bệnh).
1.5.1. Chẩn đoán lâm sàng
Trong nhiều trường hợp chẩn đoán bệnh dại gặp nhiều khó khăn. Do tính chất nguy hiểm của bệnh này và tính cấp thiết phải phòng bệnh cho người nên không nhất thiết phải đòi hỏi kết luận chó bị dại về lâm sàng, mà có thể chỉ cần nêu là chó nghi dại và xử lý như chó bị dại. Tất cả dấu hiệu thần kinh khác thường ở chó đều có thể nghi dại và tiến hành phòng bệnh cho người.
Việc chẩn đoán vẫn dựa vào các yếu tố:
+ Tiền sử bị chó cắn, sau đó chó chết vì dại.
+ Có biểu hiện sợ nước, sợ gió điển hình (Nguyễn Quốc Thái, 2014).
- Chẩn đoán phân biệt trên động vật:
+ Bệnh giả dại: con vật ngứa dữ dội, có thể chạy lung tung hay cắn vào chỗ khác, con vật không trễ hàm, không lác mắt, không sợ gió và sợ nước. Đặc biệt, không tìm thấy thể Negri trên não con vật bệnh (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1970).
+ Bệnh sài sốt chó: trong thể thể kinh chó có thể bị co giật, nhưng còn biểu hiện triệu chứng khác: mụn ở da, viêm phổi, viêm ruột… Đặc biệt, có thể Lenzt ở não, niêm mạc bóng đái và một số nơi khác ở trên con vật bệnh (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1970).
- Chẩn đoán phân biệt trên người:
+ Biểu hiện sợ nước, sợ gió có thể gặp trong nhiều bệnh ngoài dại như sốt phát ban do Rickettsia, sốt rét ác tính, sảng, nhiễm trùng. Đôi khi còn gặp ở phụ nữ khi thai nghén hoặc viêm màng tim. Ngoài ra còn gặp ở bệnh nhân uốn ván nhưng bệnh nhân uốn ván còn có biểu hiện cứng hàm và co cứng cơ liên tục.
+ Nhiều trường hợp dại bị chẩn đoán nhầm với các rối loạn tâm thần.
+ Sảng rượu cũng có các biểu hiện loạn thần nhưng không co thắt hầu họng và rối loạn hô hấp. Tình trạng bệnh liên tục chứ không từng cơn như bệnh dại (Nguyễn Quốc Thái, 2014).
+ Có những trường hợp bị chó cắn nhưng chó không phải bị dại mà vẫn sống.
Bệnh nhân vì lo sợ nên có biểu hiện bệnh tưởng tượng như lên cơn sợ gió, sợ nước tuy không co thắt cơ hầu họng và thậm chí còn sủa như chó sủa.
1.5.2. Chẩn đoán tổ chức học
Tìm bệnh tích ở hạch hình tùng của thần kinh phế vị, tế bào thần kinh và hạch bị thoái hóa, hạch hình tùng bị sưng to do sự đột nhập của bạch cầu, bạch cầu tập trung xung quanh tế bào, phá hủy dần các nơron thần kinh ngoại tiếp làm cho những nơron cuối cùng bị tiêu hủy và được thay thế bằng những khối bạch cầu. Những bệnh tích này không những trông thấy ở hạch xương sống, hạch giao cảm, hạch hình tùng của dây thần kinh phế vị mà còn thấy ở chất xám bao bọc ống não - tủy sống, hạch nhân của hành tủy và tủy sống (Nguyễn Thạnh, 2011).
Muốn tìm hạch hình tùng của thần kinh phế vị ở chó dại thì cắt sâu về phía đốt sống thứ nhất (Atlas), về phía khí quản (ở một bên), sẽ gặp dây thần kinh spinal rồi đến dây thần kinh phế vị, trên thần kinh này có một chỗ phình to ra, đó là hạch hình tùng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970).
1.5.3. Chẩn đoán virus học trên kính hiển vi
Trong tế bào chất của tế bào cảm nhiễm virus dại hay tế bào thần kinh động vật bệnh ở vùng sừng Ammon (cornu Ammoni, hay hải mã, hypocampus) nhuộm Giemsa thường thấy các thể Negri (Negri body) là những thể ấn nhập ái toan (ưa acid) chứa các hạt nhỏ ái kiềm (bắt màu bazơ) ở bên trong (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2008).
Kiểm tra thể Negri dưới kính hiển vi:
Bệnh phẩm là não của con vật nghi mắc bệnh dại chết hay bị giết. Ngâm vào dung dịch glycerin 50% có thể bảo tồn bệnh phẩm được lâu.
Áp phiến kính hoặc in vết một miếng óc của vùng sừng Ammon, rồi nhuộm bằng Giemsa, hoặc Sellers hoặc Man.
Nhuộm Giemsa: thể Negri bắt màu đỏ tươi, hồng cầu bắt màu hồng, tế bào thần kinh bắt màu xanh thẫm (Nguyễn Bá Hiên và cs 2008).
Phương pháp Sellers: thể Negri có màu đỏ tươi trên nền hồng tím của tiêu bản, nguyên sinh chất của tế bào thần kinh bắt màu xanh hồng, nhân màu xanh thẫm, hồng cầu màu đỏ gạch (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2008).
Phương pháp Man: thể Negri nhuộm màu đỏ tươi, nhiễm sắc chắc nhuộm màu xanh, tế bào màu xanh thẫm, hồng cầu màu hồng (Chu Thị Thơm và cs, 2006).
1.5.4. Tiêm truyền động vật thí nghiệm
Sử dụng chuột bạch để chẩn đoán xét nghiệm bệnh dại. Bệnh phẩm là não của con vật nghi dại được lấy ở các phần sau sừng Ammon, hai bên bán cầu não và tiểu não. Đối với con vật lớn có thể cắt lấy đầu còn với con vật nhỏ phải để nguyên con và trong cả 2 trường hợp phải giữ cho hộp sọ còn nguyên vẹn. Sau khi lấy não xong cho ngay vào dung dịch glycerin để bảo quản. Tại phòng xét nghiệm, não được lấy ra để rửa sạch, đem nghiền nát và xử lý kháng sinh để diệt vi trùng tạp nhiễm. Sau đó tiêm huyền dịch đã pha vào não của chuột bạch con với liều 0,02 ml/con và theo dõi trong một thời gian tối thiểu là 4 tuần (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002).
Nếu trong bệnh phẩm có chứa virus dại thì sau thời gian nung bệnh 10 - 15 ngày, chuột sẽ có những biểu hiện mắc bệnh như: bỏ ăn, xù lông, phản ứng chậm chạp hoặc hốt hoảng thái quá khi khua động bocal, khả năng vận động lanh lợi của chuột đã mất thăng bằng và ngã xuống. Sau đó bại liệt, bắt đầu là 2 chân sau, kế đến lan dần toàn thân. Chuột nằm nghiêng, co giật mạnh, co rúm thân mình lại khi dùng panh chạm vào thân hay gõ vào thành bocal. Ban đầu chuột còn thở mạnh, sau đó thoi thóp và chết.
Giai đoạn từ khi bị bại liệt đến lúc chết thường khoảng 1 - 2 ngày.Trong 4 tuần theo dõi, chuột tiêm không có biểu hiện bất thường thì kết luận âm tính. Mức độ chính xác của phương pháp này khá cao: 98,3 - 98,79%, tương đương với phương pháp miễn dịch huỳnh quang (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002).
Theo các chuyên gia về bệnh dại của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ở các phòng xét nghiệm có trình độ chuyên môn cao, sự tương đồng về các kết quả của phương pháp này gần như đạt đến 100%. Với phương pháp tiêm truyền trên động vật thí nghiệm, còn giúp phát hiện đến 20% các trường hợp sai sót của phương pháp giải phẫu bệnh thể Negri (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002).
1.5.5. Chẩn đoán huyết thanh học
1.5.5.1. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) trắc định kháng thể Được thực hiện như phương pháp đã mô tả trước đây (Boyden, 1951) với hồng cầu gắn kháng nguyên cải tiến. Kháng nguyên hồng cầu gắn virus được chế trước qua các bước lasota hóa, formalin hóa, tannin hóa và với virus hóa, pha thành huyễn dịch 1% (khối lượng ướt/thể tích, pha đúng nhờ so màu một huyễn dịch hồng cầu chuẩn) ta có kháng nguyên IHA. Phản ứng IHA được thực hiện trên mỗi dãy 12 lỗ khay để trắc định kháng thể trong huyết thanh. Sau khi xác định nồng độ kháng thể, các kháng huyết thanh được pha với dung dịch sinh lí để có nồng độ kháng thể có hiệu giá IHA 4log2 (kháng huyết thanh 16 IHA) để làm nguyên liệu cho phản ứng SSIA (Nguyễn Thị Hoàng Oanh và cs, 2012).
1.5.5.2. Phản ứng trắc định xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn (SSIA)
SSIA là phương pháp được thiết lập cách đây không lâu và xuất phát từ nguyên tắc của phương pháp IHA, đã sử dụng trong phát hiện kháng nguyên một số virus trong đó có virus dại (Phạm Hồng Sơn và cs, 2014). Nếu có sẵn kháng thể chuẩn kháng dại, ta thiết lập phản ứng ngưng kết ổn định với kháng nguyên IHA, khi đó, nếu cho kháng thể đó tiếp xúc trước với bệnh phẩm chứa virus dại rồi cho hỗn hợp tiếp xúc với kháng nguyên IHA thì hiệu giá ngưng kết của kháng thể chuẩn sẽ giảm do một lượng kháng thể đã tham gia phản ứng với kháng nguyên bệnh phẩm và trở nên không tự do để tham gia phản ứng với kháng nguyên IHA (Phạm Hồng Sơn, 2009). Ngược lại, nếu trong bệnh phẩm có kháng thể với lượng đủ lớn thì kháng thể này sẽ cộng hợp với kháng thể chuẩn và làm tăng hiệu giá kháng thể khi tham gia phản ứng với kháng nguyên IHA. Do virus dại bài xuất theo nước bọt, nên nước bọt của chó là bệnh phẩm thích hợp, nếu cho nước bọt tiếp xúc trước với kháng thể chuẩn trước khi tiếp xúc với hồng cầu kháng nguyên, hoặc được tăng cường nếu trong dịch bệnh phẩm có chứa kháng thể, hay có sự xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn (Phạm Hồng Sơn, 2009).
1.5.5.3. Phương pháp ELISA
Phản ứng ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là một trong những phương pháp sử dụng kháng thể đánh dấu. Phương pháp này có các biến thể khác nhau: ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp (Đinh Thị Bích Lân, 2007). Phương pháp ELISA trực tiếp sử dụng kháng thể đánh dấu enzyme (conjugate) trực tiếp chống lại kháng nguyên trong thành phần kháng nguyên của mầm bệnh. ELISA gián tiếp kháng thể phát hiện kháng nguyên virus không cần đánh dấu và kháng thể thứ hai kháng kháng thể được sử dụng như là kháng thể chỉ báo, phân biệt phản ứng dương tính và âm tính nhờ sự biến đổi hay không biến đổi của chất màu (Phạm Hồng Sơn và Bùi Quang Anh, 2006). Ưu điểm của phương pháp ELISA gián tiếp là có độ nhạy cao, giảm thiểu sự chuẩn bị kháng thể kháng virus không cần đánh dấu và kháng kháng thể được sử dụng như là kháng thể chỉ báo, nhưng chỉ sử dụng được đối với huyết thanh của loài động vật hay đối tượng nhất định (Đinh Thị Bích Lân, 2007).
1.5.5.4. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang
Nguyên lý: đánh dấu kháng thể bằng chất nhuộm màu là fluorochrome, làm cho kháng thể phản ứng với kháng nguyên đặc hiệu (nếu hiện diện) và sau đó quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (Đinh Thị Bích Lân, 2007). Trường hợp bệnh dại, khi kháng nguyên kết hợp với kháng thể được đánh dấu bằng isothiocynate fluorescin (chất nhuộm màu sử dụng nhiều nhất) sẽ xuất hiện những tiểu phần phát sáng màu xanh hoặc vàng xanh lá cây nhạt trên một nền đen. Hiện nay, phương pháp miễn dịch huỳnh quang cho kết quả chẩn đoán xét nghiệm nhanh nhất và chính xác nhất (98 -
99,4%) so với các phương pháp khác. Đồng thời có thể được sử dụng ở các phòng xét nghiệm chuyên về bệnh dại (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2008).
+ Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp tiến hành được khi có sẵn kháng thể kháng virus dại đã được đánh dấu chất huỳnh quang (conjugate huỳnh quang trực tiếp:
direct fluorescence-conjugated antibody). Chất huỳnh quang có thể dùng là fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethyl rhodamin-isothiocyanate (TRTC), lissamin - rhodamin B (rhodamin B 200), acid diaminonaphtylamin sulfonic (DANS),... Trước tiên ta làm tiêu bản vết in, lát cắt hoặc làn mỏng trên phiến kính từ bệnh phẩm là não, nước bọt,... của vật nghi dại, để khô trong không khí rồi cố định bằng cách ngâm vào acetone lạnh −10 - −20°C (cố định bằng cách này giữ được tính kháng nguyên của bệnh phẩm). Phủ tiêu bản bằng 1 - 2 giọt conjugate huỳnh quang trực tiếp, để ở nhiệt độ phòng 30 phút đến 1 giờ, rồi đem rửa nước, để khô và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (chú ý: trong phòng tối). Phản ứng dương tính khi tiêu bản phát sáng, do conjugate không bị nước rửa trôi (nhờ liên kết đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể) nên chất huỳnh quang trên đó phát bức xạ dưới sự kích thích của bức xạ quang học thích hợp (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2008).
+ Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp thực hiện được khi có conjugate huỳnh quang gián tiếp, tức chất được nhuộm huỳnh quang là kháng thể kháng epitope của kháng thể loài động vật cần nghiên cứu (Đinh Thị Bích Lân, 2007), ví dụ, thỏ được tối miễn dịch bằng IgG của chó rồi lấy máu thỏ chiết kháng thể chống IgG chó rồi đem đánh dấu bằng chất huỳnh quang FITC ta có conjugate huỳnh quang gián tiếp thỏ kháng chó: Rab/antiDog(IgG/FITC). Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp đa năng hơn phản ứng huỳnh quang trực tiếp. Khi có kháng nguyên chuẩn ta có thể phát hiện được kháng thể và ngược lại. Độ nhạy của phản ứng cũng cao hơn nhiều. Sau khi cố định tiêu bản kháng nguyên (chuẩn hoặc bị kiểm) ta phủ tiêu bản bằng 1 giọt kháng thể (bị kiểm hoặc chuẩn), ủ ẩm ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút đến 1 giờ ta rửa bằng nước rồi phủ bằng conjugate huỳnh quang gián tiếp kháng loài thích hợp. Sau một thời gian ủ ẩm lại đem rửa nước, làm khô rồi hiển vi. Kết quả phản ứng tương tự như trên (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2008).
1.5.6. Phương pháp PCR
PCR được ứng dụng có giá trị cao trong việc phát hiện ARN đặc hiệu của virus trong dịch nước bọt, mảnh sinh thiết, dịch nước tiểu, dịch não tủy (Swanepoel và cs, 1993). Đây là phương pháp hai bước nhân gen liên tục. Ban đầu lấy ARN làm khuôn tổng hợp ADN tương bổ do enzyme RT xúc tác, sau đó dùng phản PCR khuếch đại đoạn ADN đặc hiệu nhờ Taq ADN polymerase và cặp mồi gắn một cách đặc hiệu vào 2 vị trí của ADN khuôn sao cho việc nhân lên mồi này sẽ cho sản phẩm làm khuôn ADN một sợi làm khuôn cho mồi kia và ngược lại. Ưu điểm của phản ứng này là kết
quả cho nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hạn chế là không phát hiện những trường hợp nhiễm virus trước đây, chi phí cao và cần kỹ thuật viên giàu kinh nghiệm.
Các phương pháp ELISA, PCR, IFAT, CFT đều cho phép chẩn đoán sớm, nhanh và chính xác bệnh dại từ 90 - 96%.Tuy nhiên, khó áp dụng ở các địa phương vì đòi hỏi các trang thiết bị và các chế phẩm dùng cho chẩn đoán rất đắt tiền. Để phát hiện kháng thể, một số quy trình ELISA đã được phát triển (Viện y tế cộng đồng TP. HCM, 2014).