CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. PHẢN ỨNG XÉT NGHIỆM
2.4.1. Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) và pha virus 4 HA
Phản ứng HA giữa virus vaccine dại và huyễn dịch hồng cầu ngan không có sự khác biệt với các mô tả trước đây (Hirst, 1941, mô tả trong Cottral, 1989) với việc vận dụng khay vi chuẩn độ 96 lỗ (8 dãy × 12 lỗ/dãy) áp dụng xét nghiệm một lần được 8 mẫu. Trình tự các bước như sau:
Bước 1: Cho vào tất cả cỏc lỗ của mỗi dóy 25 àL dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0,85%).
Bước 2: Cho 25 àL virus vaccine dại vào lỗ thứ nhất rồi bằng chớnh pipet (ống hỳt định lượng) đú trộn bằng cỏch hỳt nhả 4 - 5 lần rồi hỳt chuyển 25 àL sang lỗ thứ
hai, tiếp tục trộn chuyển cho đến hết lỗ thứ 10 thỡ bỏ 25 àL (để chừa hai lỗ 11 và 12 không có virus làm đối chứng âm).
Bước 3: Cho vào tất cả cỏc lỗ của mỗi lỗ 25 àL huyền dịch hồng cầu ngan 0,5%
(huyền dịch này sử dụng cho tất cả các phản ứng tiếp theo: HI, SSDHI; lắc đều thường xuyên khi sử dụng làm phản ứng để có sự đồng đều).
Bảng 2.1. Sơ đồ phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)
Nguyên liệu
Lỗ số
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dung dịch nước muối sinh lý (àl)
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Dịch virus gốc (vaccine
Rabi-)
25
Trộn và chuyển 25 àL từ lỗ thứ nhất sang lỗ kế tiếp bờn phải. Hỳt bỏ 25 àL khỏi lỗ 10 sau khi trộn xong.
Lỗ 11 và lỗ 12 là hai lỗ đối chứng dương và đối chứng âm
- -
Huyền dịch
HC 1% (àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Bước 4: Để yên và đọc kết quả phản ứng bằng mắt thường sau 15 - 60 phút phụ thuộc vào kết quả ở 2 lỗ số 11 và 12, đọc từng dãy từ khi khồng cầu ở hai lỗ đối chứng âm của mỗi dãy chìm ở tâm đáy khay tạo thành một chấm đỏ. Lỗ có ngưng kết hồng cầu biểu hiện màu đỏ đều của huyền dịch hồng cầu, không tạo thành chấm đỏ đậm ở tâm đáy lỗ khay và tương phản với lỗ đối chứng âm. Hiệu giá ngưng kết hồng cầu được xác định là độ pha loãng lớn nhất của virus còn cho phản ứng ngưng kết hồng cầu. Số lỗ có ngưng kết hồng cầu của mỗi dãy phản ứng cho phép đọc kết quả phản ứng, như ngưng kết ở 5 lỗ khay ở mỗi dãy cho biết nồng độ virus trong dịch virus gốc (vaccine) được xét nghiệm ở dãy đó là 5 log2 tương ứng nồng độ virus 25 = 32 đơn vị ngưng kết hồng cầu (32 HA).
Bước 5: Pha virus gốc để có dịch virus làm việc nồng độ 4 HA dựa vào kết luận phản ứng trên. Nếu đã có 4 HA (2 log2) thì giữ nguyên, nếu 3 log2 (8 HA) thì pha thêm dung dịch nước muối sinh lý cho loãng 2 lần (tỷ lệ 1:1), nếu có 4, 5 hoặc 6,...
log2 thì pha loãng 4, 8 hoặc 16,... lần (tỷ lệ pha 1:3; 1:7; hoặc 1:15,...). Kiểm tra lại dịch virus 4 HA bằng phản ứng HA với 4 lỗ khay (lần lượt cho dung dịch nước muối
sinh lý vào 4 lỗ cho virus vào lỗ thứ nhất, trộn chuyển để có dãy 2 HA, 1 HA, 0,5 HA và 0,25 HA, rồi cho hồng cầu vào ủ và đọc kết quả sau 15 - 60 phút, kết quả 2 lỗ bên trái ngưng kết và hai lỗ bên phải không ngưng kết là đúng nồng độ 4 HA. Nếu không đúng và có 3 lỗ ngưng kết thì pha thêm dung dịch nước muối sinh lý, nếu chỉ 1 lỗ ngưng kết thì phải pha thêm dung dịch virus gốc và thử lại phản ứng 4 HA.
2.4.2. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) và pha kháng thể 4 log2 (hay 16 HI)
* Nguyên lý phản ứng:
Phàn ứng HI được thực hiện nhằm phát hiện kháng thể dại chó trong mẫu huyết thanh kiểm tra.
**Tiến hành phản ứng HI:
Phản ứng tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn 96 lỗ đáy chữ U. Để xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu virus dại trong huyết thanh chó mỗi dãy 12 lỗ sử dụng cho một phản ứng.
Bước 1: Cho vào tất cả cỏc lỗ 25 àL dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0,9%)
Bước 2: Cho vào lỗ thứ nhất 25 àL huyết thanh cần kiếm. Trộn đều bằng cỏch hút nhả hút nhả, rồi hút qua lỗ thứ 2 và tiếp tục các thao tác cho đến lỗ 10 thì hút bỏ 25 àL. Chừa lỗ thứ 11 và 12 khụng cú huyết thanh làm đối chứng õm tớnh khỏng thể.
Bước 3: cho vào tất cả cỏc lỗ từ số 1 đến 11 mỗi lỗ nhỏ 25 àL dung dịch cú chứa virus 4HA, chừa lỗ thứ 12 làm đối chứng không virus lẫn không kháng thể. Để yên 10 phút.
Bước 4: Cho vào tất cả cỏc lỗ mỗi lỗ 25 àL huyền dịch hồng cầu 4 HA đó được kiểm tra ở mục trên. Để yên và chờ đọc kết quả sau khoảng 15 - 60 phút phụ thuộc kết quả lỗ thứ 12 (chỉ bao gồm hồng cầu và dung dịch sinh lý), khi đó hồng cầu ở lỗ 12 đã chìm xuống tạo thành chấm đỏ ở tâm lỗ khay. Phản ứng ngăn trở ngưng kết cho hình ảnh đọc được bằng mắt thường: các hồng cầu chìm xuống và tạo thành chấm đỏ đậm ở đáy của lỗ, tương tự như ở lỗ thứ 12 và đối lập với lỗ thứ 11 có hồng cầu không chìm xuống tâm đáy lỗ. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất của huyết thanh còn cho phản ứng dương tính.
Các mẫu huyết thanh dương tính được pha loãng để có nồng độ kháng thể 4 log2 (tức 16 HI). Với các mẫu 4 log2 (có hiệu giá HI biểu hiện ở lỗ thứ nhất đế lỗ thứ 4) thì để nguyên, các mẫu 5, 6, 7... log2 được pha loãng 2, 4, 8... lần (tỷ lệ huyết thanh/dung dịch nước muối sinh lý tương tự là 1:1, 1:3, 1:7...). Bảo quản các mẫu huyết thanh 4 log2 trong từng ống nhỏ mỗi ống 1 mL ở nhiệt độ khoảng -20 oC chuẩn bị cho phản
ứng SSDHI phát hiện virus dại. Mỗi lần thực hiện xét nghiệm SSDHI cần giải đông một số ống huyết thanh vừa đủ cho số mẫu cần kiểm.
Bảng 2.2. Sơ đồ phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Nguyên liệu
Lỗ số
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Pha loãng huyết thanh
Dung dịch nước muối sinh lý (àl)
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Kháng huyêt thanh cần kiểm (àl)
25
Trộn và chuyển 25 àL từ lỗ thứ nhất sang lỗ kế tiếp bờn phải. Hỳt bỏ 25 àL khỏi lỗ 10 sau khi
trộn xong. Lỗ 11 và lỗ 12 là hai lỗ đối chứng dương và đối chứng âm
- -
Cho KN Dịch virus
4HA 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Cho HC HC 1%
(àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 2.4.3. Phản ứng trắc định xê lệch ngăn trở ngưng kết hồng cầu (SSDHI)
* Nguyên lý phản ứng:
Dịch lọc bệnh phẩm tiếp xúc trước với kháng huyết thanh, nếu chứa kháng nguyên virus dại thì sẽ làm giảm kháng thể đặc hiệu trong kháng huyết thanh, phản ứng sẽ biểu hiện lệch trái so với dãy chuẩn.
** Tiến hành phản ứng SSDHI:
Phản ứng được tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn 96 lỗ đáy chữ U. Ta đặt khay nằm dọc, được 12 dãy lỗ, mỗi dãy có 8 lỗ. Trên mỗi khay có 11 mẫu cần kiểm được thực hiện kèm theo một mẫu chuẩn làm đối chứng. Ghi số thứ tự các lỗ từ 1 đến 8 trên đầu khay.
Các dãy mẫu kiểm tra ta tiến hành các bước như sau:
Bước 1: Dựng pipet cho vào lỗ số 2 đến số 8 của mỗi dóy, mỗi lỗ cho 25 àL dung dịch nước muối sinh lý NaCl (pH7,2), (để trống 1 lỗ thứ nhất).
Bước 2:Cho vào lỗ số 1 của cỏc dóy 25 àL dịch chiết mẫu bệnh phẩm (dịch nước bọt chó), mỗi lỗ đầu dãy chứa một mẫu (ghi số mẫu ở đầu mỗi dãy).
Bước 3: Hỳt 25 àL khỏng huyết thanh chuẩn 4log2 cho vào mỗi lỗ thứ nhất của mỗi dóy, dựng pipet trộn và hỳt 25 àL chuyển từ lỗ thứ nhất sang lỗ thứ 2 rồi sang lỗ thứ 3 và lần lượt đến lỗ thứ 8 thỡ hỳt bỏ 25 àL.
Bước 4:Cho vào 25 àL dung dịch virus 4HA từ lỗ thứ nhất đến lỗ thứ 7.
Bước 5: Cho vào tất cả cỏc lỗ 25 àL huyết dịch hồng cầu 1%.
Đối chứng âm (phản ứng chuẩn) được thực hiện ở dãy cuối cùng của mỗi khay, gồm các bước sau:
Cho vào tất cả cỏc lỗ khay của dóy làm đối chứng 25 àL nước muối sinh lý.
Nhỏ vào lỗ thứ nhất 25 àL huyết thanh chuẩn, hỳt trộn và chuyển 25 àL sang lỗ thứ 2 và tiếp tục trộn chuyển như vậy cho đến hết dóy thỡ hỳt bỏ 25àL.
Nhỏ dung dịch virus 4HA từ lỗ thứ nhất đến lỗ thứ 7.
Nhỏ vào tất cả cỏc lỗ 25 àL huyết dịch 1% hồng cầu.
Đậy nắp khay để ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút đến 4 giờ, kiểm tra kết quả khi phản ứng ngưng kết hồng cầu của dãy đối chứng âm biểu hiện rõ.
Bảng 2.3. Sơ đồ tiến hành phản ứng trắc định xê lệch ngăn trở ngưng kết hồng cầu (SSDHI):
3A. Thành phần của một trong số 11dãy kiểm trên một khay vi chuẩn độ 12 dãy × 8 lỗ
Nguyên liệu
Lỗ số
1 2 3 4 5 6 7 8
Dung dịch nước muối
sinh lý (àL) - 25 25 25 25 25 25 25
Dịch nước bọt (àL) 25 -
Kháng huyết thanh
chuẩn 4log2 (àL) 25
Trộn và chuyển 25àL từ một lỗ sang lỗ kế tiếp bên phải. Cứ thế đến lỗ số 7 thì hút bỏ
25àL sau khi trộn xong
-
Dịch virus 4HA 25 25 25 25 25 25 25 -
HC ngan 1% (àL) 25 25 25 25 25 25 25 25
3B. Thành phần của một dãy đối chứng (duy nhất) trên một khay vi chuẩn độ 12 dãy × 8 lỗ nêu trên
Nguyên liệu
Lỗ số
1 2 3 4 5 6 7 8
Dung dịch nước muối
sinh lý (àL) 25 25 25 25 25 25 25 25
Dịch nước bọt (àL) - -
Kháng huyết thanh
chuẩn 4log2 (àL) 25
Trộn và chuyển 25àL từmột lỗ sang lỗ kế tiếp bờn phải. Cứ thế đến lỗ số 7 thỡ hỳt bỏ 25àL
sau khi trộn xong
-
Dịch virus 4HA 25 25 25 25 25 25 25 -
HC ngan 1% (àL) 25 25 25 25 25 25 25 25
***.Đọc kết quả:
Đọc kết quả khi dãy chuẩn thể hiện: 4 lỗ đầu và lỗ thứ 8 không có ngưng kết hồng cầu chìm xuống tâm lỗ khay. Có thể gặp trường hợp 3 lỗ đầu hay 5 lỗ đầu của dãy chuẩn không ngưng kết (do nồng độ kháng nguyên gắn hồng cầu thay đổi ngẫu nhiên). Khi đo đường chuẩn sẽ là sau 3 hoặc 5 lỗ khay đầu tương ứng.
Phản ứng âm tính: không có sự xê lệch lỗ ngưng kết đầu so với dãy đối chứng (lổ số 4 là lỗ đầu không ngưng kết).
Phản ứng dương tính: có sự xê lệch lỗ ngưng kết đầu sang trái (ngưng kết cuối cùng ở các lỗ 3, 2, hoặc 1) so với dãy đối chứng.