Xác định thành phần và cấu trúc hóa học của pheromone giới tính của

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian, địa điểm và phương tiện

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.2.5 Xác định thành phần và cấu trúc hóa học của pheromone giới tính của

Mục tiêu: Xác định thành phần và cấu trúc hóa học của pheromone giới tính của ngài sâu đục trái bưởi.

Thời gian: Từ tháng 2/2016 đến tháng 5/2016

Địa điểm: Mẫu pheromone ly trích sẽ được gởi đến phân tích tại Phòng thí nghiệm Sinh thái học hóa chất, Trường Đại học Nông nghiệp và Công nghệ Tokyo (Tokyo, Nhật Bản).

Cách tiến hành: Bằng các kỹ thuật phân tích Sắc ký khí – Điện râu đầu (GC-Electroantennographic detector, GC-EAD) và Sắc ký khí - khối phổ theo mô tả của Vang, 2006 (1).

3.2.5.1 Phân tích Sắc ký khí – Điện râu

Nhằm định vị các thành phần pheromone giới tính trong mẫu ly trích trên biểu đồ sắc ký khí, mẫu pheromone ly trích và những chất chuẩn tổng hợp được phân tích bằng một máy GC-EAD. Trong đó:

- Máy sắc ký khí (GC) là GC HP 5890 series được lắp cột mao dẫn DB-23 (0,25 mm ID x 30 m; J&W Scientific), đầu dò i-on hóa ngọn lửa (flame ionization detector, FID) và buồng bơm mẫu split/splitless. Nhiệt độ của buồng bơm mẫu được ổn định ở 2200C. Khí mang (carrier gas) là helium. Ở đoạn cuối của cột mao dẫn, một khớp nối hình chữ Y chia luồng khí mang ra làm hai phần bằng nhau, một phần đi về FID và phần còn lại đi qua một bộ phận chuyển nhiệt (2200C) trước khi vào một ống dẫn thủy tinh (đường kính 0,7 cm, bên trong được thổi không khí ẩm ở tốc độ 330 mL/phút) để đến EAD. Để tránh sự ngưng tụ, luồng khí mang của GC được hòa với khí nitrogen ở ngay phía trước khớp nối hình chữ Y. Chương trình nhiệt độ sử dụng cho phân tích được bắt đầu ở 800C,

43

giữ ở 800C trong 1 phút, tăng lên 2100C ở tốc độ 80C/phút và giữ ở 2100C trong 15 phút.

- EAD bao gồm 2 điện cực bằng bạc bên ngoài được áo một lớp clorua bạc (AgCl), một bộ phận tiếp nhận, một bộ phận khuếch đại và một bộ phận lọc tín hiệu. Râu đầu của bướm đực 2–3 ngày tuổi được cắt cẩn thận ở gần gốc và một đọan ngắn ở đỉnh (tránh làm gãy râu), sau đó lắp vào hai đầu điện cực của EAD đã được làm ướt bằng nước muối sinh lý (giúp tạo sự tiếp xúc điện, giữ cho râu cố định và kéo dài thời gian hoạt động của râu đầu) (Vang et al., 2005). Tín hiệu đáp ứng với pheromone từ râu đầu được khuếch đại và lọc trước khi in ra dưới dạng biểu đồ (EAG).

3.2.5.2 Phân tích Sắc ký khí – Khối phổ

Phổ khối lượng (Mass spectrum) của mẫu pheromone ly trích, các chất chuẩn tổng hợp được ghi nhận bằng máy liên hợp Sắc ký khí – Khối phổ với GC HP 6890 series và đầu dò MS (Mass Selective Detector) HP 5973. Sự ion hóa được thực hiện theo kiểu va chạm ion (EI mode) ở điện thế 70 eV và nhiệt độ 2300C. Phổ khối lượng được đặt trong khoảng m/z từ 40 – 500. Cột sắc ký được dùng trong phân tích là cột mao dẫn DB-23 (capillary column, 0.25 mm ID x 30 m; J&W Scientific). Chương trình nhiệt độ của máy sắc ký dùng cho phân tích mẫu pheromone ly trích và các chất chuẩn tổng hợp là 800C (trong 1 phút), tăng lên 2100C ở tốc độ 80C/phút và giữ ở 2100C trong 15 phút. Dẫn xuất DMDS được ghi nhận bởi máy the HP-5 column (0.25 mm ID, 30 m length, 0.25 μm film thickness; J & W Scientific, Folsom, CA, USA) với nhiệt độ được duy trì ở 100°C trong 1 phút và được lập trình tối thiểu ở 15°C/phút tới 280°C.

3.2.6 Tổng hợp các thành phần pheromone giới tính của Citripestis sagitiferella

Mục tiêu: Tổng hợp các thành phần pheromone giới tính của ngài sâu đục trái bưởi.

Thời gian: Từ tháng 7/2016 đến tháng 11/2016

Địa điểm: Tại phòng thí nghiệm Phòng trừ Sinh học, Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp, trường Đại Học Cần Thơ (tổng hợp) và Trường Đại học Nông nghiệp và Công nghệ Tokyo (Tokyo, Nhật Bản) (thẩm định mẫu tổng hợp).

Cách tiến hành: Xem các mục 3.2.6.1; 3.2.6.2 và 3.2.6.3

44

3.2.6.1 Tổng hợp các thành phần pheromone giới tính chứa một nối đôi trong phân tử (các hợp chất E11-14:OAc và Z11-14:OAc)

Các hợp chất (E)-11-tetradecenyl acetate (E11-14:OAc) và (Z)-11- tetradecenyl acetate (Z11-14:OAc) được tổng hợp thông qua phản ứng Wittig với chất phản ứng ban đầu là hợp chất thương mại 11-bromo-undecan-1-ol như trình bày trong (Hình 3.3).

HO Br MOMO Br

MOMO PPh3Br

OMOM

OMOM

OH

OH

OAc

OAc

a b

c

d e

f

(1) (2)

(3)

(4a)

(4b)

(5a)

(5b)

E11-14:OAc

Z11-14:OAc Hình 3.3 Con đường tổng hợp các hợp chất E11-14:OAc và Z11-14:OAc.

a) Dimethoxymethane/LiBr/p-TsOH; b) Triphenylphosphine/900C; c) propanal/n- BuLi/THF; d) 0.5N HCl/MeOH; e; 15%AgNO3 in silica gel; f) Anhydride

acetic/pyridine.

Sau khi nhóm chức rượu (OH) của hợp chất 11-bromo-1-undecanol (hợp chất 1) được bảo vệ bằng cách chuyển thành MOM ether (hợp chất 2). Hợp chất 2 được khuấy với triphenylphosphine ở 90oC trong 72 hrs, cho đến khi hình thành hỗn hợp sệt như keo (muối phosphonium, hợp chất 3). Thông qua phản ứng Wittig dưới điều kiện ba-sơ của n-BuLi trong dung môi THF, muối phosphonium được kết hợp với propanal hình thành hỗn hợp của các hợp chất (E)-11-tetradecen-1-ol MOM (4a) và (Z)-11-tetradecen-1-ol MOM (4b). Loại bỏ sự bảo vệ nhóm chức rượu của MOM ether. Hỗn hợp của các hợp chất (E)-11- tetradecen-1-ol (E11-14:OH) và (Z)-11-tetradecen-1-ol (Z11-14:OH) được phân tách và làm tinh khiết bằng cột sắc ký mở sử dụng hỗn hợp 15% AgNO3 trong silica gel làm pha tĩnh. Tiếp theo acetyl hóa các hợp chất E11-14:OH và Z11- 14:OH thu được các hợp chất E11-14:OAc và Z11-14:OAc.

45

3.2.6.2 Tổng hợp thành phần pheromone giới tính chứa hai nối đôi liên hợp trong phân tử (hợp chất Z9,E11-14:OAc)

Thành phần pheromone chứa hai nối đôi trong phân tử, hợp chất (9Z,11E)-9,11-tetradecadienyl acetate (Z9,E11-14:OAc) được tổng hợp bằng con đường trình bày trong Hình 3.4 Sau khi bảo vệ nhóm chức rượu (OH) của hợp chất 9-bromo-1-nonanol (hợp chất 1) bằng MOM ether (hợp chất 2). Hợp chất 2 được khuấy với triphenylphosphine ở 90oC trong 72 hrs, cho đến khi hình thành hỗn hợp sệt như keo (muối phosphonium, hợp chất 3). Thông qua phản ứng Wittig với (E)-2-pentanal (E2-5:Ald) dưới điều kiện ba-sơ của Sodium bis(trimethylsily)amide trong dung môi THF để tạo thành hợp chất (9Z,11E)- 9,11-tetradecadien-1-ol MOM (hợp chất 4) (độ tinh khiết của đồng phân Z,E là 94%). Sau khi loại bỏ sự bảo vệ nhóm chức rượu, đồng phân (9E,11E)-9,11- tetradecadien-1-ol (E9,E11-14:OH) được loại bỏ bằng cách khuấy hỗn hợp với hợp chất tetracyanoethylene trong dung môi THF trong 12 giờ. Acetyl hóa của hợp chất (9Z,11E)-9,11-tetradecadien-1-ol (Z9,E11-16:OH) tạo thành hợp chất (9Z,11E)-9,11-tetradecadienyl acetate (Z9,E11-14:OAc).

Br OH Br OMOM

BrPh3P OMOM OMOM

OH OAc

a b

c

d e

f

(1) (2)

(3) (4)

(5) Z9,E11-14:OAc

Hình 3.4. Con đường tổng hợp hợp chất Z9,E11-14:OAc (nguồn: Uehara et al., 2013) a) Dimethoxymethane/LiBr/p-TsOH; b) Triphenylphosphine/900C; c) Pentanal/Sodium bis(trimethylsilyl)amide/THF; d) 0.5N HCl/MeOH; e) Tetracyanoethylene/THF; f) anhydride acetic/pyridine.

3.2.6.3 Thẩm định cấu trúc hóa học của mẫu tổng hợp

Mẫu tổng hợp của các thành phần hóa học ở mỗi giai đoạn tổng hợp sẽ được gởi đến phòng thí nghiệm Sinh thái học hóa chất, trường Đại học Nông nghiệp và Công nghệ Tokyo để xác định bằng các phân tích GC-MS và NMR (Nuclear magnetic resonance spectrometry).

46