4.2 Đặc điểm hình thái, sinh học và khả năng gây hại của sâu đục trái bưởi
4.4.2 Tổng hợp các hợp chất Z9,E11-14:OAc
Hợp chất (9Z,11E)-9,11-tetradecadienyl acetate (Z9,E11-14:OAc) được tổng hợp bằng con đường tổng hợp trình bày trong Hình 3.4
4.4.2.1 1-Bromo-9-methoxymethoxy-nonane (2)
Hợp chất 9-Bromo-1-nonanol (3,0 g; 13,4 mmol) được khuấy với LiBr (1,38 g) và p-TsOH (190 mg) trong DMM (60 mL) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Các bước tiếp theo của phản ứng được thực hiện tương tự như trình bày ở Mục 4.4.1.1 thu được hợp chất methoxymethyl (MOM) ether (2) (3,09 g; 11,6 mmol) đạt hiệu suất 86,6%.
- Dữ liệu GC-MS: Rt 13,71 phút; Phổ khối lượng (MS, m/z): 45 (base);
61; 55; 69; 81; 95; 109; 123; 235 và 267.
- Dữ liệu NMR: 1H NMR (ppm): 1,29 (10H, broad); 1,52-1,62 (2H, tt, J = 6,88; 6,67 Hz); 1,79-1,88 (2H, tt, J = 7,13; 7,18 Hz); 3,35 (3H, s); 3,37-3,41 (2H, t, J = 6,88 Hz); 3,48-3,52 (2H, t, J = 6,63 Hz) và 4,60 (2H, s). 13C NMR (ppm):
26,14; 28,12; 28,68; 29,28; 29,35; 29,70; 32,79; 33,97; 55,06; 67,80 và 96,36.
4.4.2.2 (9Z,11E)-9,11-tetradecadien-1-ol MOM ether (4)
Hợp chất (2) (3,09 g; 11,6 mmol) được khuấy với triphenylphosphine (3,42 g; 13 mmol) ở 90oC cho đến khi hình thành dạng giống như keo (gum-like material, khoảng 72 giờ). Sau khi để nguội xuống nhiệt độ phòng, bình phản ứng được thêm vào 50 mL dung môi THF, tiếp tục thêm vào từng giọt dung dịch sodium bis(trimethylsilyl)amide (13 mL). Đợi cho đến khi hỗn hợp trong bình chuyển sang màu đỏ cam và tan hoàn toàn (khoảng 30 phút), dung dịch của hợp chất E2-5:Ald (1,0 g; 11,6 mmol, pha loãng trong 10 mL THF) được cho vào từng giọt, tiếp tục khuấy 30 phút. Phản ứng được kết thúc bằng cách rót vào 100 mL nước lạnh (nước đá) và ly trích bằng n-hexane (100 mL x 3 lần). Phần n- hexane ly trích được rửa lần lượt với dung dịch 1N HCl (100 mL) và dung dịch NaHCO3 bão hòa. Sau khi bay hơi dung môi, phần còn lại trong bình được tinh lọc bằng cột sắc ký mở sử dụng silica gel làm pha tĩnh thu được hợp chất
90
(9Z,11E)-9,11-tetradecadien-1-ol MOM ether (4) (1,74 g; 6,83 mmol), đạt hiệu suất 58,9%.
- Dữ liệu GC-MS: Rt 14,02 phút; MS (m/z): 45 (base); 55; 67; 81; 96; 121;
135; 209 và 254.
4.4.2.2 (9Z,11E)-9,11-tetradecadien-1-ol
Hợp chất MOM ether 4 (1,74 g; 6,83 mmol) được khuấy trong dung dịch 0,5N HCl trong methanol (100 mL) ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ. Tiếp theo, 100 mL nước được thêm vào bình phản ứng và hỗn hợp được rót vào phễu phân tách để ly trích bằng n-hexane (100 mL x 3 lần). Phần n-hexane ly trích được rửa lần lượt với dung dịch NaHCO3 bão hòa (100 mL). Sau khi bay hơi dung môi, phần còn lại trong bình được thêm vào 50 mL dung dịch của tetracyanoethylene (150 mg) trong dung môi THF (50mL) và khuấy ở 39oC trong 12 giờ. Sau đó, hỗn hợp được thêm vào 50 mL nước rồi ly trích bằng n-hexane (5 mL x 3 lần).
Sau khi bay hơi dung môi, phần còn lại trong bình được tinh lọc bằng cột sắc ký mở, sử dụng silica gel làm pha tĩnh, thu được hợp chất (9Z,11E)-9,11- tetradecadien-1-ol compound (Z9,E11-14:OH) (1,02 g; 4,84 mmol), đạt hiệu suất 70,8%. Độ tinh khiết đồng phân của sản phẩm đạt >99% (kiểm tra bằng GC-MS).
- Dữ liệu GC-MS: Rt 14,95 min; MS (m/z): 41, 55, 67 (base), 82, 95, 109, 121, 192 và 210.
- Dữ liệu NMR: 1H NMR (ppm): 1,02-1,07 (3H, t, J = 7,52 Hz); 1,34 (12H, broad); 1,55-1,64 (2H, tt, J = 6,67 Hz, 6,79 Hz); 2,01 (1H, s); 2,11-2,24 (2H, td, J = 7,36 Hz; 7,26 Hz); 3,64-3,69 (2H, t, J = 6,71 Hz); 5,29-5,37 (1H, dt, J = 10,08 Hz; 7,52 Hz); 5,68-5,78 (1H, dt, J = 15,05 Hz; 6,58 Hz); 5,94-6,02 (1H, dd, J = 10,96 Hz; 10,88 Hz) và 6,28-6,37 (1H, dd, J = 15,13 Hz; 15,09). 13C NMR (ppm): 13,66; 25,71; 25,88; 27,66; 29,17; 29,37; 29,46; 29,70; 32,77;
63,06; 124,66; 128,58; 130,13 và 136,17.
4.4.2.3 (9Z,11E)-9,11-tetradecadienyl acetate
Hợp chất Z9,E11-14:OH (1,02 g; 4,84 mmol) được khuấy trong acetic anhydride (3,0 mL) và pyridine (30 mL) ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ, thêm vào 50 mL nước để ngừng phản ứng. Sau đó, hỗn hợp được rót vào phễu phân tách để ly trích bằng n-hexane (50 mL x 3 lần). Phần n-hexane ly trích được rửa lần lần lượt với dung dịch 1N HCl và dung dịch NaHCO3 bão hòa. Sau khi bay hơi dung môi, phần còn lại trong bình được tinh lọc bằng cột sắc ký mở, sử dụng silica gel làm pha tĩnh, thu được hợp chất (Z9,E11-14:OAc) (1,09 g; 4,33 mmol),
91 đạt hiệu suất 89,6%.
- Dữ liệu GC-MS: Rt 14,83 phút; MS (m/z): 43; 55; 61; 67 (base); 79; 95;
107; 121; 135; 149; 192 và 252 (Hình 4.22)
- Dữ liệu NMR: 1H NMR (ppm): 0,93-0,98 (3H, t, J = 7,48 Hz); 1,24 (12H, broad); 1,35-1,44 (2H, m); 1,98 (3H, s); 2,08-2,20 (2H; td; J = 6,53 Hz;
7,31 Hz); 3,67-3,72 (2H, t, J = 6,7 Hz); 4,90-4,98 (1H; dt; J = 10,79 Hz; 7,52 Hz); 5,29-5,39 (1H; dt; J = 15,10 Hz; 6,57 Hz); 5,55-5,63 (1H; dd; J = 10,92 Hz;
10,88 Hz) và 5,90-5,98 (1H; dd; J = 13,72 Hz; 15,01). 13C NMR (ppm): 13,65;
21,02; 25,87; 27,63; 28,57; 29,13; 29,19; 29,35; 29,66; 31,10; 64,65; 124,65;
128,61; 130,07; 136,16 và 171,28.
Hình 4.22 Phân tích GC-MS của hỗn hợp các hợp chất (9Z,11E)-9,11-tetradecadienyl acetate
Con đường tổng hợp sử dụng phản ứng Wittig chọn lọc cấu hình Z của nối đôi đã tổng hợp thành công hợp chất Z9,E11-14:OAc (Hình 3.4). Mặc dù độ tinh khiết đồng phân (isomeric purity) của sản phẩm từ phản ứng chọc lọc (Z selective Wittig reaction, đồng phân Z,Z) chỉ vào khoảng 94%, tuy nhiên, dư lượng của đồng phân E,E (hợp chất (9E,11E)-9,11-tetradecadien-1-ol) đã được
92
loại bỏ bằng cách khuấy hỗn hợp trong dung dịch của tetracyanoethylene trong dung môi THF. Kết quả phản ứng acetyl hóa của hợp chất (9Z,11E)-9,11- tetradedien-1-ol (độ tinh khiết đồng phân >99% được kiểm tra bởi GC-MS) tạo hợp chất tinh khiết Z9,E11-14:OAc.
Các hợp chất mạch thẳng có chứa hai nối đôi liên hợp (conjugated diene) thường được tổng hợp bằng các con đường tổng hợp chọn lọc, trước tiên, thông qua phản ứng kết hợp chéo (cross coupling reaction) để kết hợp một alkyne với một alkene halide tạo thành hợp chất có chứa liên hợp ene-yne (-CH=C-C≡C-), hoặc phản ứng Cadiot-Chodkiewicz để tạo thành hợp chất chứa liên hợp hai nối ba (conjugated diyne, (-CH=C-C≡C-), phản ứng khử nối ba theo sau sẽ tạo thành hợp chất chứa hai nối đôi liên hợp (Diene compound) (Yadav và Reddy, 2000;
Gries et al., 2004; Mori, 2009; Yan et al., 2014). Mặt khác, Nishida et al. (2003) đã tổng hợp các hợp chất C16 mạch thẳng có chứa hai nối đôi liên hợp bằng con đường thông qua phản ứng Wittig với các hợp chất diol được sử dụng làm chất phản ứng ban đầu (starting reagent). Trong con đường tổng hợp, bằng việc chọn lọc chất phản ứng chứa đồng thời cả hai nhóm chức hydroxyl và halide, MOM ether theo đó được chọn làm bảo vệ nhóm chức hydroxyl để đáp ứng với điều kiện nhiệt độ cao ở phản ứng tạo thành phosphonium ylide, qua đó hợp chất thương mại 9-bromo-1-nonanol và E2-5:Ald được sử dụng làm chất phản ứng.
4.5 Hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp đối với ngài Citripestis sagitiferella ở điều kiện ngoài đồng
Dựa trên các kết quả xác định thành phần và cấu trúc hóa học và tổng hợp hóa học của pheromone giới tính trình bày ở các Mục 4.1 và 4.2, các hợp chất E11-14:OAc, Z11-14:OAc và Z9,E11-14:OAc được điều chế thành mồi pheromone giới tính và đánh giá hiệu quả hấp dẫn ngoài đồng. Kết quả cho thấy mồi pheromone chưa hấp dẫn thành trùng đực.
93
Bảng 4.9 Số lượng ngài Citripestis sagitiferella đực vào bẫy trong thí nghiệm 1 đánh giá khả năng hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp đối với Citripestis sagitiferella. (Thời gian thực hiện: Tháng 11/2017 – 11/2018)
Nghiệm thức Thành phần (mg/tuýp) Số lượng ngài Citripestis sagitiferella đực
(con/bẫy) E11-
14:OAc
Z11- 14:OAc
Z9,E11- 14:OAc
Hỗn hợp 1 0,0 0,0 0,5 0,0
Hỗn hợp 2 0,5 0,0 0,0 0,0
Hỗn hợp 3 0,5 0,05 0,0 0,0
Hỗn hợp 4 0,5 0,05 0,05 0,0
Hỗn hợp 5 0,5 0,0 0,05 0,0
Đ/c (*) âm 0,0 0,0 0,0 0,0
Đ/c dương 01 ngài cái chưa bắt cặp 0,0
(*) Đ/c: Đối chứng
Kết quả Bảng 4.9 cho thấy các hỗn hợp pheromone không có hiệu lực hấp dẫn ngài đực. Do thành phần pheromone của một số loài khá phức tạp, một số thành phần cấu tạo nên pheromone của loài được tạo ra từ bên ngoài tuyến pheromone của các loài này (Wang et al. 2010). Ví dụ trường hợp loài sâu đục trái cây Conogethes punctiferalis đã được xác định thành phần pheromone (Konno et al., 1982). Tuy nhiên, sau đó, Xiao et al. (2012) đã tiếp tục nghiên cứu và xác định thêm rằng chính 2 hợp chất hydrocarbon nằm ở phần biểu bì thành trùng cái mới có vai trò làm gia tăng hoạt tính của các thành phần của pheromone được ly trích từ đốt bụng.
Các nghiên cứu gần đây cho thấy sự hấp dẫn giới tính đối với các loài ngài thuộc tổng họ Pyraloidea cần bổ sung hydrocarbon chưa no vào thành phần mồi pheromone giới tính như ở trường hợp các loài Dioryctria abietivorella (Millar et al., 2005), Amyelois transitella (Kanno et al., 2010), Conogethes punctiferalis (Xiao et al., 2012), Omphisa anastomosalis (Yan et al., 2014) và loài Maruca vitrata (Downham et al., 2003. Việc thiếu nguồn hydrocarbon bổ sung vào thành phần mồi pheromone có thể là nguyên nhân đưa đến hiệu quả hấp dẫn ngoài đồng thấp. Nhiều nghiên cứu cho thấy, bổ sung thành phần T23 (Z3,Z6,Z9-23:H) và P23 (Z3,Z6,Z9,Z12,Z15-23:H) vào thành phần pheromone đều gia tăng hiệu quả hấp dẫn ngoài đồng (Trần Văn Hiếu và Lê Văn Vàng, 2017; Cabbera et al., 2001; El Sayed et al., 2012); Xiao et al.,2012, Yan et al., 2014; Millar, 2005;
Kanno et al., 2010).
94
Bảng 4.10 Số lượng ngài Citripestis sagitiferella đực vào bẫy trong thí nghiệm 2 đánh giá khả năng hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp đối với Citripestis sagitiferella. (Thời gian thực hiện: Tháng 11/2017 – 11/2018)
Nghiệm thức
Thành phần (mg/tuýp) Số lượng ngài Citripestis sagitiferella đực
(con/bẫy) E11-
14:OAc
Z11- 14:OAc
Z9,E11- 14:OAc
T23
Hỗn hợp 6 0,0 0,0 0,5 0,05 0,0
Hỗn hợp 7 0,5 0,0 0,0 0,05 0,0
Hỗn hợp 8 0,5 0,05 0,0 0,05 0,33
Hỗn hợp 9 0,5 0,05 0,05 0,05 0,0
Hỗn hợp 10 0,5 0,05 0,05 0,0 0,0
Đ/c âm 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Đ/c dương 01 ngài cái chưa bắt cặp 0,0
Bảng 4.11 Số lượng ngài C. sagittiferella đực vào bẫy trong thí nghiệm 3 đánh giá khả năng hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp đối với C. sagittiferella. (Thời gian thực hiện: Tháng 11/2017 – 11/2018)
Nghiệm thức Thành phần (mg/tuýp) Số lượng ngài Citripestis E11-14:Oac Z11-14:Oac T23 sagittiferella đực
(con/bẫy)
Hỗn hợp 11 0,5 0,0 0,05 0,0
Hỗn hợp 12 0,5 0,05 0,05 0,0
Đ/c âm 0,0 0,0 0,0 0,0
Đ/c dương 01 ngài cái chưa bắt cặp 0,0
Bảng 4.12 Số lượng ngài Citripestis sagitiferella đực vào bẫy trong thí nghiệm 4 đánh giá khả năng hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp đối với Citripestis sagitiferella. (Thời gian thực hiện: Tháng 11/2017 – 11/2018)
Nghiệm thức Thành phần (mg/tuýp) Số lượng ngài E11-14:Oac Z9,E11-14:OAc P23 Citripestis
sagitiferella đực (con/bẫy)
Hỗn hợp 13 0,5 0,0 0,0 0,0
Hỗn hợp 14 0,5 0,05 0,0 0,0
Hỗn hợp 15 0,5 0,0 0,05 0,0
Đ/c âm 0,0 0,0 0,0 0,0
Đ/c dương 01 ngài cái chưa bắt cặp 0,0
95
Bảng 4.13 Số lượng ngài Citripestis sagitiferella đực vào bẫy trong thí nghiệm 5 đánh giá khả năng hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp đối với Citripestis sagitiferella. (Thời gian thực hiện: Tháng 11/2017 – 11/2018)
Nghiệm thức Thành phần (mg/tuýp) Số lượng ngài E11-14:OAc P23 T23 Citripestis
sagitiferella đực (con/bẫy)
Hỗn hợp 16 0,5 0,0 0,0 0,0
Hỗn hợp 17 0,5 0,05 0,0 0,0
Hỗn hợp 18 0,5 0,0 0,05 0,0
Đ/c âm 0,0 0,0 0,0 0,0
Đ/c dương 01 ngài cái chưa bắt cặp 0,0
Kết quả ghi nhận ở các Bảng 4.10; 4.11; 4.12 và 4.13 cho thấy mồi pheromone giới tính tổng hợp sau khi thêm một số thành phần phụ T23 và P23 vào vẫn chưa cho hiệu quả hấp dẫn đối với ngài Citripestis sagitiferella đực. Hầu hết các kết quả đánh giá ngoài đồng của các thành phần pheromone giới tính ở các loài thuộc tổng họ Pyraloidae đều cho hiệu quả hấp dẫn rất thấp, cụ thể như trường hợp các loài sâu đục trái đậu Etiella zinckenella (Tóth et al., 1996), loài sâu đục dây khoai lang Omphisa anastomosalis (Wakamura et al., 2010), loài sâu đục trái cây Conogethes punctiferalis (Konno et al., 1982), loài sâu kéo màng Hellula undalis (Arai et al., 1982)…, điều này có thể trong thành phần pheromone của sâu đục trái bưởi còn có một hoặc một vài thành phần phụ nào đó chưa được phát hiện. Ngoài ra, kết quả ở nghiệm thức ngài cái cũng không hấp dẫn thành trùng đực (Bảng 4.9; 4.10; 4.11; 4.12 và 4.13). Do cơ chế bắt cặp của côn trùng rất phức tạp (Xu et al., 2010). Hành vi bắt cặp là một chuỗi các hành vi, yếu tố liên tục và tương tác với nhau: Tìm nơi con cái ở, nhận biết được chính xác vị trí con cái, giao phối… (Jervis et al, 2007). Theo Deisig et al. (2014), pheromone của thành trùng cái tiết ra phải tiếp xúc và tương tác với các thành phần trên cây và sẽ tạo thành một số hợp chất, chính những hợp chất này định hướng cho thành trùng đực tìm tới vị trí chính xác của con cái để bắt cặp. Nghiên cứu của Joyce et al., (2014) trên loài Cotesia flavipes cũng cho kết quả tương tự, pheromone giới tính sau khi được con cái tiết ra phải tiếp xúc được với mô lá, cành của vật chủ, sau đó tín hiệu pheromone mới được khuếch đại lên nhiều lần mới có khả năng dẫn dụ được thành trùng đực. Quan sát của Romero et al.
(2014) trên loài Dalbulus maidis cũng chỉ ra rằng, trước khi bắt cặp, một trong những hành vi bắt buộc là thành trùng cái phải di chuyển và vỗ cánh. Vì vậy, trong các thí nghiệm ở mục 4.5, do thành trùng cái được đặt trong lồng, và lồng lại đặt trong bẫy mái che, có thể điều kiện này chưa mô phỏng đầy đủ các yếu tố cần phải có nào đó cho quá trình bắt cặp của sâu đục trái trong điều kiện tự nhiên, đây có thể là nguyên nhân làm cho nghiệm thức ngài cái chưa hấp dẫn được thành trùng đực.
Ứng dụng pheromone giới tính như là chất gây nhiễu (mating disruptance) để ngăn chặn sự tiếp xúc giữa thành trùng đực và thành trùng cái, từ đó ngăn chặn sự giao phối, sinh sản và gây hại đã được thực hiện phổ biến đối với côn
96
trùng gây hại cây trồng thuộc bộ cánh vảy (Ando, et al., 2004; Witzgall, 2010).
Gần đây, ghi nhận từ các nghiên cứu ứng dụng hóa chất tín hiệu có khả năng gây nhiễu sự tìm ký chủ để đẻ trứng của thành trùng cái cho thấy hiệu quả cao với giá thành thấp, cụ thể ứng dụng tinh dầu sả và tinh dầu tỏi để gây nhiễu đối với các loài ngài thuộc họ Crambidae như loài sâu kép màng hại cải Hellula undalis (Trần Thanh Thy và ctv., 2016) sâu đục của khoai lang Nacoleia sp. (Nguyễn Thị Hồng Lĩnh và ctv., 2016. Bên cạnh việc nghiên cứu bổ sung hydrocarbon chưa no vào mồi pheromone giới tính để tăng hiệu quả hấp dẫn, để đảm bảo tính hiệu quả của quy trình quản lý, chúng tôi cũng đồng thời nghiên cứu ứng dụng tinh dầu sả và tinh dầu tỏi, các nhóm hợp chất gây nhiễu có nguồn gốc tự nhiên cũng được xem là hóa chất tín hiệu trong việc làm giảm sự gây hại của Citripestis sagitiferella.
4.6 Hiệu quả của một số chất quấy rối đến sự gây hại của sâu đục trái Citripestis sagitiferella trên vườn bưởi
Thí nghiệm được bố trí trên vườn bưởi tại Kế Sách, Sóc Trăng theo phương pháp khối hoàn toàn ngẫu nhiên nhằm đánh giá hiệu quả của các chất quấy rối là tinh dầu sả chanh và tinh dầu tỏi ở điều kiện ngoài đồng.