1.3. Nghiên cứu tính kháng bệnh đạo ôn ở lúa
1.3.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn trên thế giới
Hiện nay, ở các quốc gia khác nhau đã phát triển bộ giống chỉ thị riêng sử dụng các dòng đẳng gen (Near Isogenic Lines - NILs) chứa một hoặc một vài gen kháng. Gần đây với sự trợ giúp của kỹ thuật sinh học phân tử (RFLP, AFLP, CAP, RGA, SSR,…) các nhà khoa học đã xác định được khoảng 40 gen kháng chính [36]. Các gen kháng này được qui tụ vào các dòng/giống lúa khác nhau phát triển các dòng/giống lúa kháng. Tuy nhiên, tính kháng đơn gen thường chỉ kháng trong giới hạn các chủng địa lý nhất định và thường
21
bị mất hiệu lực sau trồng một thời gian (thường từ 1 - 5 năm), bởi sự xuất hiện của chủng mới trong phân bố vùng địa lý đó. Năm 2005, Padmavathi và cộng sự đã dựa trên cơ sở tính kháng của các giống lúa Zenith (Pi-Z + Pia + Pi-i), Dular (Pi-ka), Tetep (Pi-kh), Tadukan (Pi-ta) đã tiến hành lai qui tụ các gen kháng vào giống lúa Co39. Kết quả đã tạo ra được dòng lúa mang gen kháng hiệu quả với các chủng nấm đạo ôn [46].
Năm 2004, Chen X.W và Cs đã sử dụng giống lúa Digu, kháng bền với đạo ôn, đây còn là một nguồn giống quan trọng cho việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn ở Trung Quốc. Gen kháng đạo ôn của giống lúa này đã được phân lập để xác định vị trí gen kháng trên nhiễm sắc thể bằng các marker phân tử. Ngoài ra, còn một số lớn các giống khác, mỗi giống chứa một gen kháng bệnh đạo ôn như gen: Piks,Pia, Pik, Pi-b, Pi- kp, Pi-ta2, Pi-ta, Pi-z, Pi-i, Pi-km,Pi-zt, Pi-t và Pi-11, và các thế hệ con lai giữa Digu và mỗi giống này đều được phân tích với các chủng kháng đạo ôn của Trung Quốc. Kết quả cho thấy, tính kháng của Digu với hai chủng kháng của Trung Quốc là ZB13 và ZB15 đều được kiểm soát bởi hai gen đơn trội, riêng biệt. Hai gen kháng này khác biệt với các gen kháng đã biết, vì vậy, chúng được thiết kế như Pi-d(t)1 và Pi-d(t)2. Bằng cách sử dụng marker phân tử RFLP: G1314A và G45 phân tích ở quần thể F2, Pi-d (t)1 được xác định nằm trên nhiễm sắc thể số 2 với khoảng cách giữa 1,2 và 10,6 cM, Pi-d (t)2 được xác định nằm trên nhiễm sắc thể số 6 với khoảng cách giữa 3,2 và 3,4 cM bằng các marker SSR là RM527 và RM3. Những kết quả này cung cấp thông tin cần thiết, khi sử dụng nhiều hơn nữa các gen kháng đạo ôn của giống lúa Digu cho mục đích chọn giống và nhân dòng các gen kháng bệnh đạo ôn ở lúa [24].
Năm 2008 Wei Li và Cs đã phân lập 160 chủng Magnaporthe oryzae (trước đây là Magnaporthe grisea) và xác định được Gen Pi20(t) có phổ kháng đạo ôn rộng ở Trung Quốc, trong đó, chủng 98095 có thể phân biệt sự có mặt của gen Pi20(t) trong cv.IR24.
Ba marker SSR được sử dụng để nhận biết gen Pi20(t) được nằm gần vùng tâm động của nhiễm sắc thể 12 và cũng nhận ra 526 dòng dễ bị ảnh hưởng ở thế hệ F2 mà có nguồn gốc từ việc lai giữa giống Asominori (một giống rất nhạy cảm) với giống kháng IR24. Marker SSR OSR32 đã lập bản đồ ở khoảng cách 0,2 cM từ Pi20(t), và Marker SSR RM28050 đã lập bản đồ từ sườn khác của Pi20(t) ở khoảng cách 0,4 cM. Ba marker SSR khác là RM1337, RM5364 và RM7102, đồng phân biệt Pi20(t). Như vậy, đây là một trong những phương pháp hữu ích trong chương trình chọn giống dựa vào dấu chuẩn marker để đưa Pi20(t) vào những dòng lúa chất lượng và đưa chủng kháng bền, rộng vào Magnaporthe oryzae [64].
Năm 2009, Y Jia đã lai giống lúa Japonica nhiệt đới Katy chứa gen kháng đạo ôn Pi-ta và giống lúa Japonica ôn đới M202 (Pi-ta) đã được lây nhiễm với chủng IB49 của Magnaporthe oryzae mà chứa Pi-ta. Con lai kháng được xác định bằng cách lai hồi quy qua năm thế hệ. Mỗi thế hệ, con lai kháng đã được lựa chọn sử dụng một chủng
22
nấm có chứa AVR-Pita, và lai với giống bố mẹ M202 dễ bị nhiễm. Hai con lai trong số 22 BC5F1 được xác định kiểu gen bằng cách sử dụng 12 marker SSR xung quanh vùng genom của Pi-ta trên nhiễm sắc thể 12. Nhóm nghiên cứu đã kiểm tra kích thước của gen đưa vào trong 43 con lai BC5F2 bằng cách sử dụng các marker SSR. Kết quả đã chứng minh rằng, một loạt các kích cỡ của ADN liên kết với thể cho đã được đưa vào giống bố mẹ hồi quy M202 và các giống ưu tú, còn ADN không được liên kết với thể cho đã bị loại bỏ khỏi cá thể BC5F2. Tuy nhiên, kích thước các đoạn xung quanh bộ gen Pi-ta khác nhau giao động từ một nửa (14Mbp) đến toàn bộ nhiễm sắc thể (27Mbp) đã được tìm thấy từ thể cho. Tương tự như vậy, các phân đoạn lớn của các kích thước có thể so sánh của vùng genom Pi-ta có nguồn gốc từ giống Tetep của Việt Nam, cũng được nhận biết trong Pi-ta của các giống lúa ở Mỹ như: Katy, Madison, Kaybonnet, và Drew. Điều này cũng xác định rằng Tetep có nhiễm sắc thể 12 giống hệt với giống Tadukan của Philippines. Nghiên cứu này chứng tỏ rằng, một tỷ lệ lớn của nhiễm sắc thể được duy trì bởi sự chọn lọc nhân tạo đối với tính kháng đạo ôn trong quá trình chọn giống [66].
Năm 2009, Kei Matsushita và Cs đã nghiên cứu khả năng kháng bệnh đạo ôn của giống lúa Chumroo, đây là giống lúa thường được trồng ở các vùng cao của Bhutan, Nhật Bản. Trong hơn 20 năm qua, giống lúa này được xem là kháng bền với đạo ôn và chưa có bằng chứng nào chứng tỏ chúng bị nhiễm. Chumroo đã được lây nhiễm với 22 chủng đạo ôn được chọn lọc theo tiêu chuẩn về các chủng khác nhau của Nhật Bản. Kết quả cho thấy, giống lúa Chumroo có khả năng kháng tất cả các chủng này. Để xác định các gen kháng, Chumroo được lai với giống lúa Koshihikari dễ bị nhiễm bệnh, các cây thu được ở thế hệ F1 có khả năng kháng bệnh. Phân tích sự khác biệt của 300 dòng bố mẹ F3 cho thấy sự khác biệt theo tỷ lệ 1:2:1 và chỉ ra rằng một gen đơn trội kiểm soát tính kháng đạo ôn với chủng Ao 92-06-2. Các locus của Chumroo (Pi46 (t)) được lập bản đồ giữa hai marker SSR là RM6748 và RM5473, nằm ở phần cuối của cánh tay dài nhiễm sắc thể số 4, sử dụng phân tích liên kết với các marker SSR. Marker gần nhất RM5473 đã liên kết với locus kháng giả định ở khoảng cách bản đồ là 3,2 cM. Trên nhiễm sắc thể, không xác định được gen nào kháng hoàn toàn, trong khi đó, lại có mặt 2 gen kháng một phần là Pi39(t) và Pikahei-1(t) được đặt trên phần cuối của nhiễm sắc thể số 4 và liên kết chặt chẽ với RM5473 [57]. Vì vậy, Kei Matsushita và Cs đã thiết kết Pi46(t) như là một locus lạ kháng đạo ôn [33].
Pattama Sirithunya và Cs (2002) đã phát triển các dòng lai tái tổ hợp từ giống Khao Dawk Mali 105, một giống thơm, dễ bị đạo ôn và giống cho gen kháng đạo ôn CT 9.993-5-10-M (CT). Một bản đồ liên kết bao gồm 2112 cM được xây dựng từ 141 dòng
23
lai tái tổ hợp (RILs), sử dụng 90 marker RFLP và 31 marker SSR. Phân lập 15 chủng nấm đạo ôn để lây nhiễm trên lá, đạo ôn cổ bông cũng được đánh giá cả trong điều kiện tự nhiên và lây nhiễm. Các QTL cho kháng phổ rộng (BRS) đối với đạo ôn lá được nằm trên nhiễm sắc thể 7 và 9. Đặc biệt, QTLch9 đã được lập bản đồ gần locus Pi5(t).
QTLch7 nằm gần với một QTL kháng đã được lập bản đồ trước đây. Cả hai locus đều cho thấy tương tác alen có ý nghĩa. Các kiểu gen có alen CT ở cả QTLch7 và QTLch9 cho khả năng kháng cao nhất. Hai QTL đạo ôn cổ bông nằm trên nhiễm sắc thể 5 và 6.
Sự trùng hợp ngẫu nhiên của BRS và các QTL kháng đồng ruộng đều nằm trên nhiễm sắc thể số 7 đã đưa ra ý tưởng rằng BRS có thể phản ánh phổ kháng rộng đối với đạo ôn lá lúa. Điều này sẽ đặt nền móng cho sự phát triển của chương trình chọn giống dựa trên dấu chuẩn (MAS) để cải thiện giống Dawk Mali Khoa 105 và nhiều giống gạo thơm khác nhưng dễ bị nhiễm đạo ôn [49].
Ứng dụng công nghệ chuyển gen để tạo giống kháng là một trong những hướng được quan tâm hiện nay. Với mục đích tăng cường khả năng kháng đạo ôn, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã chuyển một số gen từ các nguồn thực vật khác nhau vào lúa.
Năm 1997, Stark và cộng sự đã chuyển gen tổng hợp Stilbene ở nho vào tế bào trần của giống lúa Nipponbare nhờ PEG. Những tế bào mang gen chuyển được sàng lọc, tái sinh thành cây hoàn chỉnh sau đó được xử lý với dịch nấm Pyricularia oryzae để đánh giá tính kháng. Các kết quả của nghiên cứu cho thấy, tính kháng với nấm Pyricularia oryzae của các dòng lúa chuyển gen đã được tăng lên [55].
Năm 1999, Nishizawa và cs đã sử dụng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium để chuyển gen Cht-1 và Cht-3 vào giống lúa Nipponbare và Koshihikari.
Gen Cht mã hoá cho enzyme Chitinaza thuỷ phân chitin, một trong những protein liên quan đến khả năng gây bệnh của nấm [41].
Trichosanthin (TCS) là gen mã hoá cho protein ức chế hoạt động của ribosom trong một số loài nấm gây bệnh (bao gồm cả nấm đạo ôn Pyricularia oryzae). Trên cơ sở này, năm 2002 Yuan và cộng sự đã thiết kế vector chuyển nạp mang gen TCS và chuyển vào giống lúa Zhonghua 8 của Trung Quốc. Nghiên cứu cho thấy, sự biểu hiện của protein TCS đã tăng cường khả năng bảo vệ của các dòng lúa chuyển gen trước sự lây nhiễm của nấm Pyricularia oryzae nhưng lại không gây độc đến thực vật [67].
Trong một nghiên cứu khác, Kanzaki và cộng sự (2002) đã thành công trong việc tăng cường khả năng kháng nấm đạo ôn của lúa bằng cách tạo ra các dòng lúa chuyển gen mang gen Defensin (gen có khả năng ức chế sự phát triển của nấm đạo ôn được tách dòng từ cây Wasabia japonica) [32].
24
Gần đây, hướng nghiên cứu nhằm tạo ra những dòng lúa mang gen kháng Pi cũng được các nhà khoa học quan tâm. Tác giả Chen và cs (2010) đã sử dụng 3 vector biểu hiện khác nhau là pCB 6.3kb, pCB 5.3kb và pZH01 2.72kb chuyển gen kháng Pi-d2 (gen có phổ kháng rộng đối với nhiều chủng nấm đạo ôn) vào các giống Zhonghua 9, Taipei 309 và Nipponbare. Kết quả cho thấy, 9 dòng lúa chuyển gen mang gen Pi-d2 có khả năng chống chịu đa dạng với 39 chủng nấm đạo ôn, tỷ lệ kháng cao nhất đạt 91,7%
[22].
Năm 2011, Amit và cs đã chuyển gen kháng Pi54 vào giống lúa Taipei 309 (giống dễ nhiễm bệnh) sử dụng vector chuyển gen pCAMBIA. Kết quả cho thấy, các dòng lúa mang gen Pi54 từ thế hệ T1 đến thế hệ T3 có khả năng kháng với nhiều chủng nấm đạo ôn [18].