1.5 Thuốc trừ cỏ và gen chống chịu thuốc trừ cỏ
1.5.2 Gen kháng thuốc trừ cỏ
Để tạo tính kháng với Glyphosate, hầu hết các loại cây trồng kháng Glyphosate đều biểu hiện một loại EPSPS không nhạy cảm với Glyphosate có nguồn gốc từ Agrobacterium spp. Ngoài ra, nhiều loại cây trồng khác nhau cũng đã được chuyển với một trong hai gen vi khuẩn pat hoặc bar từ Streptomyces spp. tạo khả năng kháng thuốc trừ cỏ gốc glufosine. Những gen này mã hóa enzyme phosphinothricin acetyl transferase (PAT) có tác dụng giải độc l-PPT (phosphinothricin). Các gen chuyển khác có trong cây trồng HT tạo ra tính kháng với các chất ức chế ALS3 (gen gm-hra), 2,4- D (gen aad-1 và aad-12) hoặc Dicamba (gen dmo).
Enzyme EPSPS và gen CP4 EPSPS
Họ enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) hiện diện trong cây một lá mầm và vi sinh vật. Các enzyme EPSPS đã được phân lập từ cả 2 nguồn trên, những đặc tính của chúng đã được nghiên cứu một cách sâu rộng. Các enzyme này đơn chức năng có khối lượng phân tử 44 - 48 kD (Kishore và Shah, 1988). Protein EPSPS xúc tác quá trình chuyển hóa nhóm enolpyruvyl từ phosphoenol pyruvate (PEP) thành 5-hydroxyl của shikimate-3-phosphate (S3P) - liên quan đến hợp chất phosphate vô cơ dễ tiêu và 5-enolpyruvylshikimate-3- phosphate (Donn và Kửcher, 2012). Sản phẩm biến dưỡng 5-enolpyruvyl shikimate- 3-phosphate là sản phẩm cuối cùng trong con đường của axit shikimic. Axit shikimic là một cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp các amino axit thơm (phenylalanine, tryptophan và tyrosine), lignin, các hợp chất flavonoid, các hợp chất phenolic cũng như các chất chuyển hóa thứ cấp khác là tetrahydrofolate, ubiquinone và vitamin K. Điều đặc biệt là con đường shikimate và các protein EPSPS vắng mặt trong động vật có vú, cá, chim, bò sát và côn trùng. Ngược lại, nó hiện diện trong các phân tử thơm nguồn gốc từ axit shikimic, chiếm tới 35% hoặc hơn sinh khối của thực vật (Donn và Kửcher, 2012).
Gen CP4 EPSPS được phân lập từ Agrobacterium sp., chủng CP4, một loại vi khuẩn đất phổ biến. EPSPS đã được giải trình tự DNA và protein mã hóa EPSPS có khối lượng 47,6 kD, bao gồm một polypeptide đơn dài 455 axit amin. Protein CP4 EPSPS biểu hiện trong thực vật chuyển gen chống chịu thuốc trừ cỏ gốc Glyphosate với mức tương đương enzyme EPSPS thực vật nội sinh, ngoại trừ việc làm giảm mức độ giống nhau về cấu trúc với Glyphosate (Molin, 2017), là gen lý tưởng nhất trong họ EPSPS đã và đang được ứng dụng rộng rãi để tạo cây chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ.
Ở thực vật không chống chịu thuốc trừ cỏ gốc Glyphosate, Glyphosate bám vào enzyme EPSPS nội sinh và khóa quá trình sinh tổng hợp 5-enolpyruvyl-shikimate-3- phosphate, làm cho cây bị đói các axit amin thơm và các chất chuyển hóa thứ cấp thiết yếu (Molin, 2017). Thêm vào đó, hoạt tính của ezym EPSPS bắt nguồn từ việc
hình thành phức tam hợp của EPSPS-S3P-glyphosate. Sự hình thành phức hợp này xảy ra theo trật tự với việc bám của Glyphosate vào vị trí chỉ sau khi hình thành phức nhị hợp EPSPS-S3P. Việc bám của Glyphosate khóa hiệu quả sự bám của PEP và ngăn ngừa EPSPS xúc tác cho S3P và PEP. Tuy nhiên, sự giống nhau về cấu trúc CP4 EPSPS với PEP là cao hơn so với Glyphosate, vì vậy, CP4 EPSPS được ưu tiên bám vào PEP trong sự hiện diện của Glyphosate và xúc tác ngay tức khắc như không có mặt của Glyphosate (Molin, 2017). Sai khác trong sự thu hút việc bám của Glyphosate là cơ sở cho khả năng chống chịu thuốc trừ cỏ gốc Glyphosate ở thực vật được chuyển gen CP4 EPSPS.
Như đã biết, một số vi sinh vật có 5- enolpyruvoyl-shikimate-3-phosphate synthetase (EPSPS) kháng với thuốc trừ cỏ Glyphosate. Phiên bản của enzyme mà vừa kháng với Glyphosate vừa vẫn đủ hiệu quả để điều khiển sự sinh trưởng thực vật thích hợp được xác định bởi các nhà khoa học Monsanto sau nhiều thử nghiệm trên
vi khuẩn Agrobacterium chủng CP4 - được tìm thấy trong cột thải ở cơ sở sản xuất thuốc trừ cỏ Glyphosate (Green và Owen, 2011). Gen CP4EPSPS này đã được phân lập và chuyển vào cây đậu nành. Năm 1996, đậu nành biến đổi gen đã được trồng thương mại (James, 1997). Hiện tại, các cây trồng kháng Glyphosate như đậu nành, ngô, dầu cải, cỏ linh lăng, bông và lúa mì vẫn đang được phát triển. Cây trồng BĐG đã trở thành tiêu chuẩn ở Hoa Kỳ. Năm 2015, diện tích ngô, đậu nành và bông ở Mỹ được trồng giống biến đổi gen chống chịu thuốc trừ cỏ Glyphosate với tỷ lệ 89, 94 và 89% (USDA, 2015).
Enzyme PAT và gen bar
Cuối những năm 1980, các nhà khoa học đã phát hiện ra enzyme trong loài Streptomyces có thể gây bất hoạt có chọn lọc đối với phosphinothricin tự do; gen mã hóa enzyme được phân lập từ Streptomyces hygroscopicus kháng bialaphos (gen bar) và gen mã hóa enzyme được phân lập từ Streptomyces viridochromeogenes là phosphinothricin acetyltransferase (gen PAT). Hai gen và protein của chúng có mức độ tương đồng 80% về DNA và tương đồng 86% về axít amin, cùng mã hoá cho 158 axit amin (Donn và Kửcher, 2012).
Cây trồng biến đổi gen chống chịu thuốc trừ cỏ Glufosinate đã được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền chuyển các gen bar hoặc PAT từ Streptomyces vào những giống cây trồng thớch hợp (Donn và Kửcher, 2012; Green và Castle, 2010). Năm 1995, cõy trồng kháng Glufosinate đầu tiên là cải dầu đã được đưa ra thị trường, tiếp theo sau là ngô (năm 1997), bông (năm 2004) và đậu nành (năm 2011) (Irby và ctv, 2013).
Tính đến 2011, có 38 sự kiện chuyển gen bar hay PAT ở 8 loại cây trồng đã được chấp thuận cho thương mại hóa ở 11 nước, bao gồm củ cải đường, cải dầu, đậu nành, bông, lúa, ngô… Trong đó, cây bông chuyển gen bar (LLCotton25) được Công ty Bayer thương mại hóa lần đầu vào năm 2004 ở Mỹ. Bên cạnh đó, sự kiện của Công ty Dow AgroSciences sử dụng gen bar như chỉ thị chọn lọc (Widestrike cotton) cũng đã được chấp thuận để kiểm soát cỏ dại (Irby và ctv, 2013).