3.2 Đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen chống chịu thuốc trừ cỏ
3.2.1 Chọn lọc cây chuyển gen bar chống chịu thuốc trừ cỏ gốc Glufosinate
Bảng 3.15 Số cây mọc, số cây kháng, tỷ lệ (%) kháng kháng sinh và chống chịu
TT
Mô sẹo T0
Glufosinate của cây chuyển gen bar
Vector
1 barII2 CB3
2 barII2 CB15
3 barIIF2 CFB2
4 barIIF6 CFB6
5 barIIF2 CFB18
9 barIF3 BF8 10 barIF2 BF12 11 barIF3 BF17 12 barIF4 BF25
pCB301pCAMBIA1300
112 95 73 107
42 132
16 84 42 66 198 111 36 102
91 82 42
91
Hạt của 116 cây T0 được gieo thành từng dòng, đánh giá tính chống chịu sinh, tính chống chịu thuốc trừ cỏ, chọn dòng chống chịu, xác định số bản sao gen chuyển bằng Southern blot (cho cây T0 tương ứng). Kết quả phân tích tính kháng kháng sinh và chống chịu thuốc trừ cỏ của cây chuyển gen bar được tổng hợp trong bảng 3.15 và phụ lục 11.
Đánh giá tính kháng kanamycin cho 47 dòng mang gen bar hữu thụ cho thấy đều có khả năng kháng kanamycin. Tuy nhiên, tỷ lệ kháng ở thế hệ T1 rất biến động 13,8 - 40,5% (bảng 3.15 và phụ lục 11.1). Trường hợp 1 bản sao gen sẽ cho tỷ lệ phân ly tính kháng:nhiễm ở T1 là 3:1, nhưng hầu hết các dòng đều không đạt.
Đánh giá tính kháng hygromycin cho 69 dòng T1 chuyển gen pCAM:bar được tổng hợp trong bảng 3.15 và phụ lục 11.2 cho thấy, tất cả các dòng đều kháng hygromycin. Tỷ lệ kháng rất khác nhau, biến động 16,7% (BF11 và BF23) - 100%
(B12: có 2 cây mọc) cũng cho thấy cây T1 chưa ổn định tính chống chịu sinh.
Kiểm tra sự có mặt của gen bar trong cây cho kết quả, gen bar cũng có mặt trong cây thế hệ T1 kháng kanamycin và hygromycin (Hình 3.20A).
Đánh giá tính chống chịu thuốc trừ cỏ: Hạt của toàn bộ cây T1 và cây đối chứng không chuyển gen được gieo trồng, sau đó xử lý với Glufosinate (nồng độ 0,6 kg ai./ha) ở giai đoạn 4 - 5 lá. Kết quả xử lý cho 47 dòng mang gen pCB301:bar chống chịu kanamycin thu được 18 dòng có cây chống chịu Glufosinate, nhưng tỷ lệ chống chịu rất thấp, cao nhất đạt 21,4% (Bảng 3.15 và phụ lục 11.1). Mức độ chống chịu của các dòng đều ở mức yếu - trung bình (Hình 3.19E), so với đối chứng là Coker310 và cỏ không thể phục hồi, cháy khô (Hình 3.19G). Những dòng này, sau khi phục hồi, sinh trưởng bình thường và hữu thụ. 03 dòng CB15, CFB2 và CFB6 có mức độ chống chịu tương tự CB3. 14 dòng có cây chống chịu là CB5, CB9, CB12, CB13, CFB12, CFB13, CFB14, CFB17, CFB18, CFB19, CFB21, CFB24, CFB26 và CFB27, nhưng mức độ chống chịu thuốc trừ cỏ đều ở mức kém. Dựa trên mức độ chống chịu thuốc của từng cây, chọn được 4 dòng là CB3, CB15, CFB2 và CFB6 có mức độ chống chịu tốt hơn cả.
Hình 3.19 Cây bông chuyển gen bar thế hệ T1 trước và sau khi xử lý thuốc trừ cỏ gốc Glufosinate (nồng độ 0,6 kg ai./ha), xử lý ở giai đoạn 4 - 5 lá.
A: Trước khi xử lý; B: Sau xử lý thuốc trừ cỏ; C: Dòng không chống chịu; D, E: Dòng và cây chống chịu thuốc trừ cỏ ở mức kém; F: Dòng và cây chống chịu thuốc trừ cỏ ở mức cao; và G: đối chứng không chống chịu.
Kết quả xử lý Glufosinate cho 69 dòng T1 chuyển gen pCAMBIA:bar thu được 48/69 dòng có cây chống chịu Glufosinate và mức độ chống chịu của các dòng ở mức cao (bảng 3.15 và phụ lục 11.2). Có sự khác biệt rõ ràng về mức độ chống chịu của các dòng B (pCAMBIA1300:bar) với CB (pCB301:bar), mặc dù vùng gen PNOS-bar-TNOS của 2 vector chuyển gen là như nhau, số lượng cây mang gen tái sinh từ 2 vector này cũng khá tương đương nhau nhưng rõ ràng, các dòng B (pCAMBIA1300:bar) có mức độ chống chịu Glufosinate tốt hơn. Đối với các dòng có tỷ lệ sống:chết xấp xỉ 3:1 tương đương tỷ lệ dự kiến cho một gen trội duy nhất trong quần thể tự thụ phấn.
Việc áp dụng một loại thuốc trừ cỏ như Glufosinate ammonium có thể gây ra các phản ứng nhạy cảm khác nhau trong cỏ dại, chủ yếu là do tính biến đổi di truyền rộng của chúng. Sự nhạy cảm khác nhau có thể được giải thích bằng sự khác biệt trong chuyển vị, hấp thu và chuyển hóa thuốc trừ cỏ (Everman và ctv, 2009). Bên
cạnh đó, các yếu tố dẫn đến di truyền phi Mendel là kểu gen cây nhận đột biến do phương pháp chuyển gen, bất thường nhiễm sắc thể, allen không tương đồng, do sự tích hợp gen chuyển không ổn định hoặc im lặng gen chuyển, có thể do tương tác giữa gen chuyển và genome cây nhận (truyền gen kém, trao đổi chéo, không tương hợp nên không có đồng hợp tử) (Zhang và ctv, 2005).
Hình 3.20 Đánh giá các dòng chuyển gen bar thế hệ T1 bằng kỹ thuật sinh học phân tử A: Sản phẩn PCR gen bar trong cây chuyển gen. M: thang DNA chuẩn; (+):
plamisd pCAMBIA1300:bar; (-): Coker310; 1-24 cây chuyển gen.
B: Southern blot. (M): thang DNA chuẩn 1 kb; P: plamid pCB301:bar/PstI (+) EcoRI; 1: (-) Coker310; CB3, CB15, CFB2, CFB6 và CFB18: dòng chuyển gen.
C: Southern blot. (M): thang DNA chuẩn 1 kb; P: plamid pCAMBIA:bar/PstI (+) EcoRI; B1, B2, B4, B6, B9, B18 và BF17: dòng chuyển gen; (-): Coker310.
D: Northern blot. (M): Thang RNA chuẩn 0,5 kb; CB3, CB5, B2, B8, B9 và BF17: dòng chuyển gen; (-): Coker310.
Để chắc chắn tính chống chịu thuốc trừ cỏ Glufosinate được tạo ra bởi gen chuyển cần kiểm tra sự có mặt của gen bar, kết quả là gen bar có mặt trong cây chuyển gen thế hệ T1 (Hình 3.20A). Kiểm tra sự gắn kết của gen chuyển bằng Southern blot cho thấy 10 dòng chuyển gen giả định là CB3, CB15, CFB2, CFB6, CFB16, B1, B6, B9, B18 và BF17 mang 1 bản sao, 2 dòng B2, B4 mang 2 bản sao.
Trên đối chứng không chuyển gen Coker310 không phát hiện băng lai (Hình 3.20B, C). Kết quả này cũng xác nhận kết quả PCR và chỉ ra sự tích hợp của vùng T-DNA
trong gemome cây chuyển gen. Sự xuất hiện băng lai giữa mẫu dò là cDNA từ cây chuyển gen với RNA tổng số của 6 dòng CB3, CB5, B2, B8, B9 và BF17 (Hình 3.20D) cho thấy có hoạt động phiên mã của gen chuyển.
Đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen bar thế hệ T2
Thử nghiệm sinh học về khả năng chịu thuốc trừ cỏ ở cả cây chuyển gen và không chuyển gen thế hệ T2 cũng được áp dụng với Glufosinate. Lá của những cây không được biến đổi gen bị cháy (hình 3.21C), trong khi những cây của cây biến đổi gen không có triệu chứng như vậy (Hình 3.21B). Hình 3.21A cho thấy, trước khi phun thuốc cây bông và cỏ phát triển rất tốt, sau phun Glufosinate với nồng độ 0,6 kg ai./ha làm cho cỏ và đối chứng là Coker310 chết hoàn toàn (Hình 3.21C) và cây bông không bị ảnh hưởng(Hình 3.21B). Mức độ chống chịu của các dòng có khác nhau, chống chịu cao (Hình 3.21D) và chống chịu trung bình (Hình 3.21E). Năm dòng B1, B9, B18 và BF8, BF17 thể hiện mức độ chống chịu cao và ổn định.
Bảng 3.16 Tỷ lệ (%) cây chống chịu Glufosinate của các dòng bông chuyển gen bar thế hệ T2
TT Dòng
1 B1
2 B3
3 B6
4 B9
5 B18
6 B20
7 BF3
8 BF8
9 BF12
10 BF17
11 BF25
Đánh giá cây bông chuyển gen bar ở thế hệ T2 bằng thuốc trừ cỏ cho thấy các dòng đều có tỷ lệ cây chống chịu thuốc trừ cỏ rất cao (Bảng 3.16). Một số dòng như B1-1, B1-11, B3-3, B3-4, B6-6, B9-3, B18-1, BF3-2, BF17-1, có tỷ lệ chống chịu thuốc trừ cỏ là 100%, khả năng thuần về tính chống chịu thuốc trừ cỏ rất cao. Hơn nữa, so sánh hai vector chuyển gen cho thấy cả hai đều có thể được sử dụng để biến đổi gen trên bông, tuy nhiên, liên quan đến chống chịu thuốc Glyphosate và Glufosinate, hiệu quả chuyển gen và tỷ lệ cây chống chịu tốt hơn đạt được ở pCAMBIA1300.
Hình 3.21 Dòng bông chuyển gen bar thế hệ T2 xử lý Glufosinate ở giai đoạn 7 - 8 lá, liều lượng 0,6kg a.i/ha.
(A) trước khi phun, (B) sau phun 5 ngày, (C) đối chứng không chuyển gen Coker310, (D) Khu vực có dòng chống chịu cao (bên trái) và dòng chống chịu trung bình (bên phải).