3.3 Phân tích di truyền tính chống chịu thuốc trừ cỏ Glufosinate, các đặc điểm thực vật học và khả năng mẫm cảm với một số bệnh hại chính của cây bông chuyển gen thế hệ T 2
3.3.2 Đánh giá kiểu hình, đặc điểm nông học và tính mẫn cảm với bệnh hại của cây chuyển gen thế hệ T 2
Mức độ tương đồng về các đặc điểm thực vật học của cây chuyển gen và giống nền không chuyển gen là những chỉ tiêu đầu tiên cần đánh giá đối với các nguy cơ môi trường của cây chuyển gen (OECD, 2008). Kết quả so sánh các đặc điểm nông sinh học và hình thái chính của các dòng bông chuyển gen bar so với giống bông nền Coker310 được trình bày trong bảng 3.21.
Kết quả cho thấy, không có sự khác biệt ở mức thống kê (P ≥ 0,055) giữa các dòng bông chuyển gen bar (B9 và BF17) với đối chứng Coker310 không chuyển gen về các đặc điểm nông sinh học, gồm tỷ lệ nảy mầm, sức mọc mầm, thời gian sinh trưởng từ gieo đến nở hoa, thời gian sinh trưởng từ gieo đến nở quả, số cành quả/cây, số cành đực/cây, vị trí cành quả 1, khối lượng quả, số quả/cây.
Kết quả thu được trong bảng 3.21 cho thấy sự đồng nhất về các đặc điểm hình thái (chiều cao cây, hình dạng thân, màu sắc thân, hình dạng lá, màu sắc lá, màu sắc cánh hoa, màu sắc phấn hoa, hình dạng quả) giữa các dòng bông chuyển gen bar với giống nền Coker310 không chuyển gen. Như vậy, không có sự khác biệt giữa các dòng bông chuyển gen bar và đối chứng không chuyển gen về các đặc điểm hình thái, sinh trưởng và phát triển.
Mức độ mẫn cảm đối với các loại bệnh hại chủ yếu là một trong những tiêu chí quan trọng đánh giá khả năng thích nghi với các điều kiện ngoại cảnh và xác định năng suất của giống ở điều kiện sinh thái mới. Đề tài đã tiến hành đánh giá mức độ mẫn cảm của các dòng bông chuyển gen bar đối với một số bệnh hại chính trên cây bông như lở cổ rễ, mốc trắng, đốm cháy lá. Kết quả tổng hợp trong bảng 3.21 cho
thấy, mức độ nhiễm bệnh lở cổ rễ là tương đương nhau giữa các dòng bông chuyển gen và đối chứng không chuyển gen (P ≥ 0,195).
Bảng 3.21 So sánh các đặc điểm nông sinh học, hình thái và tính mẫn cảm với bệnh hại của các dòng bông chuyển gen bar với giống bông nền Coker310
TT Chỉ tiêu theo dõi
1 Tỷ lệ nảy mầm (%)
2 Sức mọc mầm (%)
3 Thời gian từ gieo đến nở hoa (ngày)
4 Thời gian từ gieo đến nở quả (ngày)
5 Số cành quả/cây
6 Số cành đực/cây
7 Số đốt tới cành quả 1
8 Chiều cao cây (cm)
9 Hình dạng thân
10 Màu sắc thân
11 Hình dạng lá
12 Màu sắc lá
13 Màu sắc cánh hoa
14 Màu sắc phấn hoa
15 Dạng quả
16 Khối lượng quả (g)
17 Số quả/cây
18 Tỷ lệ bệnh (%) lở cổ rễ
19 Chỉ số bệnh (%) lở cổ rễ
20 Tỷ lệ bệnh (%) đốm cháy lá
21 Chỉ số bệnh (%) đốm cháy lá
22 Tỷ lệ bệnh (%) mốc trắng
23 Chỉ số bệnh (%) mốc trắng
Các đánh giá về kiểu hình, đặc điểm nông học và tính mẫn cảm với bệnh hại giữa cây trồng chuyển gen và cây trồng truyền thống không chuyển gen có thể hỗ trợ kết luận có hay không nguy cơ trở thành cỏ dại, dịch hại có thể xâm lấn của cây trồng chuyển gen so với cây trồng truyền thống. Trong trường hợp dữ liệu thu được cho thấy không có sự sai khác về các đặc tính đánh giá thì có thể kết luận là cây trồng chuyển gen không làm tăng cường nguy cơ trở thành cỏ dại, dịch hại so với cây trồng truyền thống (OECD, 2008).
Tóm lại, các dòng bông chuyển gen bar B9 và BF17 có các đặc điểm nông sinh học (tỷ lệ nảy mầm, sức này mầm, thời gian nở hoa, thời gian nở quả, số quả/cây…) và hình thái (chiều cao cây, dạng thân, màu sắc thân, dạng lá, màu sắc lá, màu sắc hoa…) là hoàn toàn tương tự với đối chứng không chuyển gen Coker310. Mặt khác, các đánh giá về mức độ nhiễm một số bệnh hại chính trên cây bông như bệnh bệnh lở cổ rễ, bệnh mốc trắng và bệnh đốm cháy lá cũng cho thấy tính mẫn cảm với các bệnh này là tương đương nhau giữa các dòng chuyển gen bar với đối chứng không chuyển gen. Cho thấy, các dòng chuyển gen B9 và BF17 không thể hiện sự sinh trưởng vượt trội, lấn át so với giống nền Coker310.
Trong nghiên cứu này, 2 dòng chuyển gen bar B9 và BF17 đã được tạo ra, Các phân tích PCR và southern blot cho thấy tích hợp thành công gen bar vào genome Coker310. Thử tính kháng hygromycin và Glufosinate cũng cho thấy mức độ chống chịu cao với các hóa chất hygromycin B và Glufosinate. Đánh giá thêm các đặc điểm thực vật và nông học trong cả B9, BF17 và giống nền, cho thấy rằng không có sự khác biệt đáng kể về những đặc điểm này giữa B9, BF17 và giống nền của chúng. Ngoài ra, các nghiên cứu cổ điển như phân tích sự phân ly và tính di truyền đã xác nhận rằng gen bar phân ly theo quy luật Mendel cho đơn tính trạng. Phát hiện này phù hợp với Daud và ctv, 2009; Khan và ctv, 2009; Perlak và ctv, 1990; Zhang và ctv, 2005.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1- Dòng Coker310FR chọn lọc qua tái sinh liên tục ba thế hệ của giống bông Coker310 có khả năng tái sinh rất cao, thể hiện qua tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi là 95,6% và tỷ lệ cây tái sinh không dị dạng trên môi trường GR5 là 36,7%.
2- Bốn vector chuyển gen, gồm pCAMBIA1300:hpt-bar, pCAMBIA1300:hpt- EPSPS, pCB301:nptII-bar và pCB301:nptII-EPSPS được tái cấu trúc bằng cách chèn vùng P35S-EPSPS-TNOS và PNOS-bar-TNOS vào vector biểu hiện thực vật pCB301:nptII và pCAMBIA1300:hpt. Kiểm tra hiện diện của 04 gen đích và gen độc lực virC khẳng định 04 vector chuyển gen được biến nạp thành công vào vi khuẩn A. tumefaciens chủng C58/PGV2260.
3- Nhiễm mẫu thân mầm giống bông Coker310 với A. tumefaciens mang gen EPSPS và bar ở mật độ, thời gian lây nhiễm, thời gian và nhiệt độ đồng nuôi khác nhau có ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ cảm ứng, sống sót và phát sinh phôi của mô sẹo chuyển gen. Kết quả tốt nhất đạt được khi lây nhiễm vi khuẩn với mật độ OD600 0,75 trong 10 phút, đồng nuôi cấy 64 giờ ở nhiệt độ 22 oC.
4- Tương tác giữa loại mẫu/giống với tác nhân chọn lọc ảnh hưởng đến tỷ lệ tái sinh và tỷ lệ cây mang gen chuyển. Hiệu quả chuyển vector pCAMBIA1300:bar vào mẫu lá mầm dòng Coker310FR đạt cao nhất với 2,8% mô sẹo phát sinh phôi, 15,8 cây/mẫu được tái sinh, 76,0% số cây mang gen chuyển và 64,7% trong số đó hữu thụ. Hiệu quả chuyển vector pCB301:bar vào mẫu thân mầm dòng Coker310FR đạt cao nhất với 2,1% mô sẹo phát sinh phôi, tái sinh được 20,6 cây/mẫu, 30,2% số cây mang gen chuyển và 82,5% trong số cây đó hữu thụ.
5- Chọn được 5 dòng T2 chuyển gen bar B1, B9, B18 và BF8, BF17 mang 1 bản sao, có hoạt động phiên mã của gen chuyển, cây sinh trưởng đồng đều và chống chịu thuốc trừ cỏ Glufosinate cao (0,6 kg ai./ha).
6- Chọn được 5 dòng T2 chuyển gen EPSPS có 1 bản sao, có hoạt động phiên mã của gen chuyển và chống chịu trung bình với thuốc trừ cỏ Glyphosate là E7, E8, E19, EF14 và EF25, không có dòng chống chịu cao.
7- Hai dòng bông chuyển gen T2 là B9 và BF17 mang 01 bản sao gen, di truyền gen chuyển theo quy luật Mendel, chống chịu cao với thuốc trừ cỏ Glufosinate ở nồng độ 0,6 kg ai./ha, không sai khác về đặc điểm thực vật học và khả năng chống chịu bệnh hại so với giống bông nền Coker310 không chuyển gen.
2. Đề nghị
1- Sử dụng dòng Coker310FR để chuyển các gen có lợi vào cây bông.
2- Sử dụng 4 vector biểu hiện gen chống chịu thuốc trừ cỏ pCAMBIA1300:hpt-bar, pCAMBIA1300:hpt-EPSPS, pCB301:nptII-bar và pCB301:nptII-EPSPS vào giống bông khác hoặc cây trồng khác để tạo cây trồng có tính chống chịu thuốc trừ cỏ.
3- Áp dụng thông số trong quy trình chuyển gen qua trung gian A. tumefaciens cho các giống bông.
4- Đánh giá rủi ro ở quy mô sinh thái hạn chế, phát triển 2 dòng B9 và BF17 ở các thế hệ tiếp theo để đủ điều kiện làm vật liệu lai tạo giống tiến tới phổ biến giống.
CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ
1. Nguyễn Thị Nhã, Trịnh Thị Vân Anh, Võ Thị Xuân Trang, Nguyễn Ngọc Uyên Trinh, Phan Hồng Hải, Phạm Bích Ngọc, Bùi Minh Trí, Phan Thanh Kiếm, Trịnh Minh Hợp (2016). Hiệu quả chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây bông (G. hirsutum L.) qua trung gian A. tumefaciens. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, tháng 8/2016.
2. Trịnh Minh Hợp, Nguyễn Thị Nhã, Mai Văn Hào, Trịnh Thị Vân Anh, Võ Thị Xuân Trang, Nguyễn Ngọc Uyên Trinh, Phan Hồng Hải, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn, Phạm Bích Ngọc và Trần Thanh Hùng (2016). Nghiên cứu tạo giống bông kháng sâu và chống chịu thuốc trừ cỏ bằng kỹ thuật chuyển gen. Tạp chí công thương/ấn phẩm Khoa học & Công nghệ số tháng 8/2016.
3. Nguyễn Thị Nhã, Bùi Minh Trí, Phan Thanh Kiếm (2020). Chọn lọc cây bông (Gossypium hirsutum L.) chuyển gen bar chống chịu thuốc diệt cỏ gốc glufosinate. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh 19 (5): 71-79.