3.2 Đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen chống chịu thuốc trừ cỏ
3.2.2 Chọn lọc cây chuyển gen EPSPS chống chịu thuốc trừ cỏ gốc Glyphosate
Đánh giá tính kháng kanamycin cho 35 dòng chuyển gen pCB301:EPSPS đã được đánh giá tính kháng kanamycin và kiểm tra sự hiện diện của gen EPSPS trong
cây T1. Tỷ lệ kháng kanamycin biến động lớn từ 16,7% (CE35) đến 81,8% (CE28) (Bảng 3.17 và Phụ lục 12.1).
Bảng 3.17 Số cây mọc, tỷ lệ (%) kháng kháng sinh và chống chịu thuốc trừ cỏ Glyphosate của cây chuyển gen EPSPS thế hệ T1
Giống
Mô sẹo T0
nền Vec
tor Số
cây mọc
Coker310FR Coker310 EPSII4 CE5 EPSII4 CE9 EPSIIF1 CFE1 EPSIIF3 CFE16
pCB301
31 39 111
41
Coker310FR Coker310 EPSI2 E7 EPSI3 E8 EPSI7 E19 EPSIF4 EF4 EPSIF4 EF14 EPSIF8 EF25 Coker310
pCAMBIA1300
Ghi chú: (*) không đánh giá; K rõ: Không rõ band trên film X-ray
Đánh giá tính kháng hygromycin cho 58 dòng chuyển gen pCAMBIA1300:EPSPS và kiểm tra sự có mặt của gen EPSPS trong cây T1 cho thấy, cả 58 dòng đều kháng hygromycin (Bảng 3.17. và Phụ lục 12.2), nhiều dòng có sự phân ly tính kháng:nhiễm hygromycin theo tỷ lệ tương đương 3:1 như E1, E13, E15, E19, EF3, EF7, EF14, EF25 và EF31 (tỷ lệ kháng hygromycin 64,3 - 76,5%) có khả năng mang 1 bản sao gen chuyển. Những dòng còn lại có tỷ lệ kháng không theo quy
luật, đa số dòng có tỷ lệ kháng rất thấp. PCR kiểm tra sự có mặt của gen hpt trong cây kháng đều có kết quả dương tính. Như vậy, biểu hiện của gen chuyển là chưa ổn định, tỷ lệ cây không mang gen cao hơn dự tính.
Kết quả đánh giá tính chống chịu Glyphosate (phun thuốc trừ cỏ Roundup 480SC ở liều lượng 2,88 kg ai./ha,15 ml/l nước, phun 4 lít/100m2) trình bày trong bảng 3.14 và phụ lục 12.2.
Hình 3.22 Dòng bông chuyển gen EPSPS thế hệ T1 chống chịu thuốc trừ cỏ gốc Glyphosate, triệu chứng ở giai đoạn 10 ngày sau xử lý.
(A) Trước phun, (B) Sau phun 10 ngày, (C) Dòng không chống chịu, (D) Cây chống chịu trung bình (E) Dòng chống chịu
+ 18 dòng có cây kháng (bảng 3.17 và phụ lục 12.2) từ 35 dòng chuyển gen pCB301:EPSPS, tỷ lệ cây sống khá thấp từ 8,8% (CE14) đến 47,7% (CE21). Có 2 dòng cho nhiều cây sống, mức độ chống chịu tốt hơn cả, đồng đều giữa các cây và có khả năng sinh trưởng phát triển mạnh là CE5 và CEF16. Hình 3.22 là kết quả đánh giá tính chống chịu thuốc Glyphosate cho các dòng CEF16, trước khi phun (A), cỏ dại rất nhiều, sinh trưởng lấn át cây bông, sau khi phun thuốc ở nồng độ 2,88 kg ai./ha
(cao hơn liều khuyến cáo cho cỏ thường niên 1,92 kg ai./ha), cỏ đã chết hoàn toàn (B), nhiều dòng bông không chống chịu có biểu hiện úa vàng, rụng lá và chết (C) và một số dòng có cây chống chịu (D, E). Trong cùng dòng, mức độ chống chịu của từng cây khác nhau (D), cây chống chịu yếu có biểu hiện sinh trưởng kém.
Hình 3.23 Đánh giá các dòng chuyển gen EPSPS thế hệ T1 bằng kỹ thuật sinh học phân tử
A: Kết quả Southern blot gen EPSPS trong các dòng chuyển gen pcB301:EPSPS. (M) thang DNA chuẩn, (P) plasmid pCB301:EPSPS/HindIII + EcoRI; (310) giống
Coker310; (CE5, CE9, CEF4, CEF14) các dòng chuyển gen và (-) Coker310FR B: Kết quả Southern blot gen EPSPS trong các dòng chuyển gen pCAMBIA:EPSPS.
(M) thang DNA chuẩn, (P) plasmid pCAM:EPSPS/HindIII (+) EcoRI; (E7; E8, E19, EF4, EF14, EF25 và 7: Coker310
C: Kết quả Northern blot gen EPSPS. (M) thang RNA chuẩn, (CE5, CEF16, E8, và EF14) các dòng chuyển gen thế hệ T1 và Đ/C-: Coker310
+22 dòng có cây sống từ 58 dòng chuyển gen pCAM:EPSPS (Bảng 3.17 và phụ lục 11.2). Sáu dòng vừa có nhiều cây sống, cây sinh trưởng đồng đều và có mức độ chống chịu tốt nhất là là E7, E8, E19, EF4, EF14 và EE25.
9 dòng CE5 và CE9 (pCB301/Coker310), CEF1 và CEF16 (pCB301/Coker310FR), E7, E8 và E9 (pCAMBIA1300/Coker310), EF4 và EF14 (pCAMBIA1300/Coker310FR và cùng mô sẹo phát sinh phôi) được đánh giá bằng kỹ thuật Southern blot. Kết quả, xác định được các dòng có 1 bản sao (Hình 3.23A, B), kết quả cho dòng CE5 không rõ (hình 3.23A).
4 dòng CE5, CEF16, E8 và EF14 chống chịu thuốc trừ cỏ Roundup 480SC được kiểm tra lại bằng kỹ thuật Northen blot để kiểm chứng có hoạt động phiên mã của gen. Kết quả lai giữa mẫu dò là cDNA từ cây chuyển gen với RNA tổng số có xuất hiện băng lai (hình 3.23C).
Đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen EPSPS thế hệ T2
Bảng 3.18 Tỷ lệ (%) cây chống chịu thuốc trừ cỏ Glyphosate của cây chuyển gen EPSPS thế hệ T2
TT Dòng
1 E8
2 E19
3 EF4
4 EF14
5 EF25
6 CE5
7 CE9
8 CEF1
9 CEF16
Tiếp tục đánh giá tính chống chịu thuốc trừ cỏ cho cây chuyển gen EPSPS thế hệ T2 để chọn được cây mang gen ổn định, chống chịu tốt với thuốc trừ cỏ. Để có được các kết quả như dự định, sau khi đánh giá tính chống chịu thuốc trừ cỏ cho con lai từ những cây T1, các hạt tự thụ của những cây này cũng được gieo ra. Số liệu thu được trong bảng 3.15 cho thấy, các dòng E8-2, E8-7, EF14-1, EF14-4, EF14-8, EF14-10, CE9-2 và CEF1-2 đều có tỷ lệ cây kháng kháng sinh và thuốc trừ cỏ Glyphosate là 100%, như vậy các dòng này đã thuần, chọn cây đẹp để tự thụ thu quả.
Những dòng có tỷ lệ chống chịu Glyphosate xấp xỉ 3:1 (gần 75% cây sống), cho thấy trước đó, thế hệ T1 đang ở trạng thái dị hợp tử. Kết quả này hỗ trợ kết quả southern là đơn copy gen chuyển (Bảng 3.15 và phụ lục 11.3).
Hình 3.24 Dòng bông chuyển gen EPSPS thế hệ T2 chống chịu Glyphosate, triệu chứng ở giai đoạn 10 ngày sau xử lý
Kết quả thu nhận trong bảng 3.18 và phụ lục 12.3 cũng chỉ ra những dòng còn phân ly tính chống chịu thuốc trừ cỏ đều cho tỷ lệ cây sống cao hơn T1, biến động
30,9-97,9%, cho thấy gen chuyển đã ổn định hơn trong cây chuyển gen. Tỷ lệ phân ly khác biệt rõ ràng giữa T1 và T2, ở T1 tỷ lệ cây chết cao hơn, ở T2 tỷ lệ cây sống cao hơn.
Về mức độ chống chịu, những dòng chọn chỉ ở mức trung bình, hầu hết cây sống sót có lá bị cong mép, hoại tử một phần (hình 3.24) sau khi xử lý với Glyphosate 480 SC, liều lượng 2,88kg/ha. Như vậy, so với mục tiêu là chống chịu cao thì các dòng chuyển gen EPSPS chưa đạt yêu cầu. Vì vậy, đề tài không đánh giá các dòng này về đặc điểm nông sinh học và tính mẫn cảm với bệnh hại chính trên cây bông.