1.8 Sàng lọc và đánh giá cây chuyển gen
1.8.1 Sàng lọc tế bào, mô hoặc cây chuyển gen nhờ gen chỉ thị chọn lọc
Để xác định các tế bào hoặc thực vật biến đổi, điều cần thiết là phát hiện DNA ngoại lai đã được tích hợp vào nhiễm sắc thể thực vật hay chưa. Các gen kháng sinh hoặc kháng một số chất khác đã được đưa vào vùng T-DNA của các vector và được sử dụng để chọn lọc cây chuyển gen. Gen neomycin phosphotransferase (nptII) tạo tính kháng kanamycin và hygromycin phosphotransferase (hpt) tạo ra tính kháng với hygromycin là hệ thống gen đánh dấu được lựa chọn sử dụng rộng rãi nhất trong thực vật. Một số hệ thống chọn lọc thông thường khác sử dụng: kháng sinh, bao gồm chloramphenicol, gentamicin, streptomycin, bleomycin, blasticidin; thuốc trừ cỏ, bao gồm phosphinothricin, gluphosinate, Glyphosate, bromoxynil; hoặc các dấu hiệu chuyển hóa, bao gồm acetolactate synthase, threonine dehydratase, phosphomannose isomerase (Hwang và ctv, 2017).
Tính hữu dụng của một chỉ thị tính kháng phụ thuộc vào đặc điểm của tác nhân chọn lọc, gen kháng và vật liệu thực vật sử dụng. Tác nhân chọn lọc phải ức chế hoàn toàn sinh trưởng của tế bào cây không chuyển gen, tuy nhiên, ảnh hưởng đến tế bào chuyển gen ở mức thấp nhất. Cho nên, nồng độ thấp nhất của tác nhân chọn lọc, ức chế sinh trưởng của tế bào cây không chuyển gen được sử dụng để sàng lọc tế bào chuyển gen. Mức độ mẫn cảm của tế bào cây với tác nhân chọn lọc phụ thuộc vào loại thực vật, mô, giai đoạn phát triển và điều kiện nuôi cấy. Vì vậy, trước khi sàng lọc, cần phải xác định mức độ mẫn cảm trong điều kiện cụ thể của quá trình chuyển gen. Ngoài ra, mức độ kháng cũng phụ thuộc vào tín hiệu điều khiển phiên mã và dịch mã gen kháng. Vì vậy, trước khi chuyển gen, việc thử nghiệm một vài cấu trúc gen cũng rất cần thiết (Ziemienowicz, 2001).
Gen chỉ thị chọn lọc thông dụng
Theo Miki và McHugh (2004) có khoảng 50 gen chỉ thị chọn lọc được phát hiện và sử dụng trong chuyển gen thực vật. Trong đó, hầu hết các nghiên cứu chuyển gen công bố (> 90%) và các cây trồng chuyển gen được chấp nhận thương mại trên thế giới (> 95%) sử dụng gen chỉ thị chọn lọc nptII, hpt và bar. Còn theo ISB (2003), có
gần 94% thử nghiệm đồng ruộng cây trồng chuyển gen ở Mỹ trong 2 năm 2001 và 2002 sử dụng gen chỉ thị chọn lọc nptII, hpt, bar và epsp. Trong đề tài nghiên cứu này, 2 gen nptII và hpt được sử dụng làm các gen chỉ thị chọn lọc để sàng lọc nhanh các tế bào, mô hoặc cây chuyển gen kháng sâu và chống chịu thuốc trừ cỏ (Miki và McHugh, 2004).
Aminoglycoside 3’-phosphotransferase II (aph (3’)-II) hoặc nptII là chỉ thị chọn lọc được sử dụng đầu tiên và phổ biến nhất trong chuyển gen thực vật.
Enzyme này có trọng lượng phân tử khoảng 25 kDa, mã hóa bởi gen nptII (hoặc neo), có nguồn gốc từ gen nhảy Tn5 của vi khuẩn E. coli K12 và gây bất hoạt bằng phosphoril hóa một số kháng sinh chứa gốc aminoglycoside như kanamycin, neomycin, geneticin và paromomycin. Đa số, kanamycin được sử dụng như là tác nhân chọn lọc, phạm vi nồng độ kanamycin sử dụng 50 – 500 mg/L. Mặc dù tính kháng kanamycin là chỉ thị chọn lọc rất hữu ích cho nhiều loài thực vật, nhưng với một số loài thực vật khác như một số loài đậu đỗ và họ cây cỏ, thì kanamycin không có hiệu quả khi sử dụng làm chỉ thị chọn lọc (Ziemienowicz, 2001).
Tính kháng kanamycin của cây chuyển gen và con cháu chúng có thể được kiểm tra bằng thử nghiệm cảm ứng mô sẹo trên môi trường bổ sung kanamycin.
Ngoài ra, một số phân tích in vitro có thể được sử dụng để phát hiện protein nptII một cách định lượng hoặc bán định lượng. Phân tích sự nảy mầm của hạt giống trên môi trường chứa kanamycin có thể được sử dụng để đánh giá sự phân ly của gen nptII ở thế hệ con cháu của cây chuyển. Một phương pháp chọn lọc khác nữa là sử dụng dung dịch kanamycin phun cục bộ lên cây trồng trong nhà kính, nhà lưới hoặc trên đồng ruộng để chọn lọc con cháu kháng kanamycin (Ziemienowicz, 2001).
Hygromycin B là kháng sinh chứa gốc aminocyclitol, có tác dụng ức chế tổng hợp protein. Gen tổng hợp hygromycin phosphotransferase (hpt) có nguồn gốc từ vi khuẩn E. coli. Đoạn trình tự mã hóa hpt được sửa đổi để biểu hiện trong tế bào thực vật (Waldron và ctv, 1985), từ đó nó được sử dụng rộng rãi như là gen chỉ thị chọn lọc tính kháng trong chuyển gen thực vật. Các gốc axit amin gần đầu tận cùng carboxil của enzyme được loại bỏ hoặc được thay thế nhằm tăng mức độ kháng hygromycin.
Tuy nhiên, đầu C ưa nước được bảo vệ và điều này có thể cần thiết cho hoạt tính hpt mạnh. Hygromycin B độc hơn kanamycin và giết chết tế bào nhanh hơn. Chọn lọc các tế bào chuyển gen trong điều kiện in vitro áp dụng ở phạm vi nồng độ từ 20 mg/L (ở cây A. thaliana) đến 200 mg/L (ở cây cỏ đuôi trâu) (Wang và ctv, 1992).
Tính kháng hygromycin có thể được kiểm tra bằng cảm ứng mô sẹo trên môi trường chứa hygromycin. Đánh giá phân ly gen hpt ở thế hệ cây chuyển gen con cháu được phân tích bằng sự nảy mầm của hạt giống trên môi trường chứa hygromycin (Angenon và ctv, 1994).
Ở Việt Nam, các nghiên cứu chuyển gen thực vật sử dụng nhiều loại gen chỉ thị chọn lọc như nptII, hpt, bar..., tuy nhiên, nghiên cứu chuyển gen cây bông chỉ sử dụng 2 gen nptII và hpt (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 2005; Nguyễn Thị Nhã và ctv, 2014; Trịnh Minh Hợp và ctv, 2013). Đánh giá tính hữu ích của 2 gen này, các nhà nghiên cứu đều có nhận định chung:
- Gen hpt và tác nhân chọn lọc hygromycin ức chế triệt để tế bào, mô và cây bông không chuyển gen, nên hiệu quả chọn lọc cao. Tuy nhiên, hygromycin có ảnh hưởng lớn đến tế bào, mô và cây bông chuyển gen, nên các nghiên cứu chuyển gen sử dụng gen hpt có tỷ lệ cây dị dạng lớn hơn so với gen nptII; ngoài ra, tác nhân chọn lọc hygromycin đắt tiền, có độc tính cao với con người, khó bảo quản.
- Gen nptII và tác nhân chọn lọc kanamycin ức chế tế bào, mô và cây bông chuyển gen không triệt để, nên hiệu quả chọn lọc không cao bằng hpt. Tuy nhiên, kanamycin ít ảnh hưởng đến tế bào, mô và cây chuyển gen, nên các nghiên cứu chuyển gen sử dụng gen nptII có tỷ lệ cây dị dạng thấp hơn so với gen hpt; ngoài ra, tác nhân chọn lọc kanamycin dễ mua, rẻ tiền, ít độc với con người và rất dễ sử dụng và bảo quản.
Tuy nhiên, vấn đề sử dụng gen chỉ thị chọn lọc nào thì phải căn cứ vào phương pháp chuyển gen, loại mẫu biến nạp. Các nhà nghiên cứu chuyển gen bông cho rằng, nếu sử dụng phương pháp chuyển gen vi tiêm vào bầu nhuỵ qua đường ống phấn thì nên sử dụng gen nptII, còn chuyển gen qua trung gian A. tumefaciens nên sử dụng gen hpt (Trịnh Minh Hợp và ctv, 2015).
Việc nghiên cứu nồng độ thấp nhất của kanamycin và hygromycin để sàng lọc tế bào, mô và cây bông chuyển gen cũng đã được nghiên cứu, cụ thể:
Với hpt: Trịnh Minh Hợp (2012) kết luận, nồng độ hygromycin thích hợp để sàng lọc mô sẹo chuyển CryIAc (pC1300:Ubi-CryIAc) trên giống SSR60F và Coker312 là 12,5 mg/L, để nhân và chọn lọc mô sẹo chuyển gen áp dụng10 mg/L, để sàng lọc cây chuyển gen trong ống nghiệm áp dụng ≥ 20 mg/L và để sàng lọc cây chuyển gen trong nhà lưới áp dụng1.500 mg/L. Lê Trọng Tình và cộng sự (2014) cũng kết luận, nồng độ hygromycin thích hợp để cảm ứng, nhân và sàng lọc mô sẹo chuyển gen DREB2ACA (pBIG:Lip9:DREB2ACA) vào giống SSR60F và Coker312 là 10 mg/L, để sàng lọc cây chuyển gen trong ống nghiệm áp dụng 20 mg/L và sàng lọc cây chuyển gen trong nhà lưới áp dụng1.500 mg/L.
Với nptII: Khi chuyển gen P5CSM (pBI101:RD29A:P5CSM) vào giống SSR60F và Coker312 qua trung gian A. tumefaciens, Lê Trọng Tình và cộng sự (2014) kết luận, nồng độ kanamycin thích hợp để cảm ứng, nhân và sàng lọc mô sẹo chuyển gen là 75 mg/L, để sàng lọc cây chuyển gen trong ống nghiệm 200 mg/L và để sàng lọc cây chuyển gen trong nhà lưới 5.000 mg/L. Khi nghiên cứu chuyển gen CryIAc cho các giống LRA5166, TM1 và MCU9, P5CSM và DREB2ACA vào giống MCU9 bằng kỹ thuật vi tiêm vào bầu nhuỵ qua đường ống phấn, Trịnh Minh Hợp (2012) và Lê Trọng Tình và cộng sự (2014) kết luận, nồng độ kanamycin để sàng lọc cây bông chuyển gen trong nhà lưới ở trong nhà lưới từ 5.000 đến 7.500 mg/L (Lê trọng Tình và ctv, 2014; Trịnh Minh Hợp, 2012).