Chương 2. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của Gõ đỏ
Sử dụng phương pháp chuyên gia, phương pháp phân tích các kết quả, tài liệu liên quan đã có, kết hợp với quan sát mô tả, lấy tiêu bản trên các cây mẫu ở rừng tự nhiên tại Khu bảo tồn thiên nhiên Hoại Nhang, thủ đô Viêng Chăn, nước CHDCND Lào để nghiên cứu đặc điểm hình thái và vật hậu.
- Tiêu chuẩn cây mẫu: Cây được lựa chọn là cây sinh trưởng tốt, thân thẳng, không cong queo, sâu bệnh, đã cho quả ổn định ít nhất 3 năm.
- Cách thức lấy mẫu: Mỗi địa điểm lựa chọn 3 cây, mỗi cây chọn 4 cành theo các hướng Đông, Tây, Nam, Bắc để theo dõi các chỉ tiêu: thời kỳ rụng lá, thời kỳ ra chồi, ra hoa, nở hoa, kết quả; thời kỳ quả chín, rơi rụng. (ii). Nghiên cứu tách chiết ADN tổng số
- Thu thập mẫu vật: 09 mẫu lá tươi từ 03 cá thể loài Gõ đỏ được thu lấy từ KBTTN Hoại Nhang. Các mẫu lá được ký hiệu lần lượt là: AxL11, AxL12, AxL13, AxL21, AxL22, AxL23, AxL31, AxL32 và AxL33. Mẫu lá tươi ngay sau đó được cho vào túi Ziplock chứa silica gel và vận chuyển về Phòng thí nghiệm lưu trữ ở -800C cho đến khi ADN được tách chiết. Tất cả các mẫu lá thu thập cho mục đích nghiên cứu chỉ lấy từ nguồn tự nhiên, đã được định danh cùng các tiêu bản mẫu cây chuẩn hóa.
- Tách chiết ADN hệ gen: ADN hệ gen được tách chiết theo phương pháp CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) của Saghai Maroof et al., 1984 với một sự thay đổi nhỏ. Khoảng 100mg mô lá được nghiền trong cối bằng chày sứ trong 600 ml đệm CTAB (4% CTAB thay vì 2%, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 1% beta-mercaptoethanol, 100 mM Tris-HCl pH 8.0). Mẫu được chuyển vào ống ly tâm 1,5 ml và ủ ở 650C trong bể ổn nhiệt 30 phút, sau đó được chiết xuất với cùng một thể tích với chlorophorm. Các mẫu được ly tâm ở 10.000 vòng/phút. Pha dung dịch được chuyển sang ống ly tâm 1,5 ml mới.
ADN được kết tủa bằng cỏch thờm 500 àl isopropanol lạnh và ly
tâm ở 10.000 vòng/phút. ADN tủa sau đó được rửa sạch bằng cồn 70%. Làm khụ và hũa tan ADN trong 100 àl đệm TE.
(iii). Nghiên cứu khuếch đại PCR, đọc trình tự gen và phân tích dữ liệu ADN mã vạch
Ba chuỗi mã vạch ADN matK, rbcL và psbA-trnH được khuyếch đại bằng máy PCR 9700 Thermal Cycler Applied Biosystems (Mỹ). Hỗn hợp phản ứng PCR (25àl) gồm: 2,5 μl đệm 10X Taq, 2,0 μl hỗn hợp dNTP (2,0 mM), 1,0 μl cho mỗi cặp mồi (10 μM), 0,5 μl cho 5 U/μl Taq DNA polymerase, 1 μl ADN khuụn (50 ng/μl) và H20 cho tổng thể tớch đạt là 25àl.
Chu kỳ nhiệt cho PCR: 950C trong 3 phút; (950C: 30 giây, 570C-620C: 30 giây, 720C: 1 phút) lặp lại 40 chu kỳ; 720C trong 7 phút; bảo quản sản phẩm PCR ở 040C. Sản phẩm PCR được được di trên gel agarose 1,2%.
Trình tự nucleotide của mồi cho ba vùng ADN được thể hiện ở bảng 2.1.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ Kít của hãng Norgen biotek, Canada.
Trình tự nucleotide được đọc trên máy ABI PRISM®3730xl DNA Analyzer (ABI, Foster City, CA, USA).
Bảng 2.1. Danh sách và trình tự nucleotide của các cặp mồi
ADN
lục Trình tự nucleotide của mồi
lạp
matK
Mồi xuôi: 5’-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3’
Mồi ngược: 5’-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3’
rbcL
Mồi xuôi: 5’-GTAAAATCAAGTCCACCACG-3’
Mồi ngược: 5’-GTAAAATCAAGTCCACCGCG-3’
psbA- Mồi xuôi: 5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’
trnH Mồi ngược: 5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’
(iv). Xử lý, phân tích dữ liệu mã vạch ADN (DNA barcode)
Trình tự thu được được xử lý bằng các phần mềm Bioedit version 7.2.5, Clustal X 1.83 và công cụ BLAST (Bagic local Alignment Search Tool) trên NCBI (National Center for Biotechnology Information) tại địa chỉ website:
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi .
(v). Nghiên cứu đặc điểm giải phẫu, sinh lý giai đoạn vườn ươm - Giải phẫu lá
Ba mẫu lá bánh tẻ của các cá thể khác nhau trong 1 công thức thí nghiệm được lấy ngẫu nhiên, trên mỗi phiến lá, chọn 3 vị trí của phần thịt lá để giải phẫu. Giải phẫu mặt dưới của lá để đếm số lượng khí khổng và theo độ dày lá để đo độ dày các mô trong phần thịt lá. Các mẫu giải phẫu được chụp ảnh, các thông số được đo đếm trên kính hiển vi OPTIKA microscopes M - 699 có gắn Optikam PRO 3 Digital Camera.
- Xác định hàm lượng và tỷ lệ diệp lục a và b
Sử dụng phương pháp so màu của Benz et al. (1980). Xác định cường độ thoát hơi nước theo phương pháp cân nhanh của L. A. Ivanov et al. (1950).
- Xác định sức hút nước của mô thực vật:
Sử dụng phương pháp so sánh tỷ trọng của Shacdacov: Chuẩn bị 2 dãy ống nghiệm, dãy thí nghiệm (1) và dãy đối chứng (2), hai ống nghiệm song song nhau (từng đôi) có cùng nồng độ NaCl từ 0,1 M đến 1 M (cách nhau 0,1M). Lần lượt cho vào mỗi ống nghiệm ở dãy 2 với 3 ml NaCl có nồng độ lần lượt như trên; mỗi ống nghiệm thuộc dãy 1 cho vào 2 ml với thang nồng độ tương ứng như dãy 1. Dùng khoan nút chai khoan 50 mảnh lá có kích thước như nhau, rồi cho vào mỗi ống nghiệm thuộc dãy 1 là 5 mảnh/ống. Thời gian ngâm các mảnh lá khoảng 30 phút (thỉnh thoảng lắc đều). Sau đó, vớt các mảnh lá ra và thêm vào mỗi ống thí nghiệm 1 giọt nhỏ xanh metylen, lắc đều.
Dùng pipet mũi nhỏ hút giọt dung dịch thí nghiệm có màu xanh và thả từ từ vào giữa dung dịch đối chứng có nồng độ tương ứng, vừa nhả dung dịch vừa
36
quan sát chiều di chuyển của dòng dung dịch màu xanh, tìm ra nồng độ mà ở đó dòng dung dịch màu xanh đứng yên, tức là tại đó nồng độ dịch bào và nồng độ dung dịch muối bằng nhau (Ctb = Cdd), đây là dung dịch đẳng trương. Do vậy, sức hút nước của của tế bào cũng bằng sức hút nước của dung dịch đẳng trương (Stb = Sdd). Stb = Sdd = R. T. Ci
Trong đó: Stb: Sức hút nước của tế bào; Sdd: Sức hút nước của dung dịch;
R = 0,0821 = hằng số khí; C: Nồng độ dịch bào; i: Hằng số đẳng trương; i = 1 + α (n-1); α: Bậc điện ly; n: Hệ số ion khi điện ly.
- Xác định sức chịu nóng của lá:
Sử dụng phương pháp của Maxcop: Đun nước sôi, pha nước vào cốc sứ đến nhiệt độ lần lượt là: 350 C, 400 C, 450 C, 500 C, 550 C, 600 C. Ngâm lá trong các cốc nước nóng với thời gian 30 phút, rồi vớt lá ra cho vào cốc nước ở nhiệt độ thường. Sau đó, thay nước trong cốc bằng dung dịch HCl 0,2 N, sau 20 phút vớt lá ra và tính diện tích lá bị tổn thương (%). So sánh diện tích bị tổn thương, theo nguyên lý lá nào bị tổn thương nhiều thì khả năng chịu nóng kém và ngược lại.