Đối tượng nghiên cứu của đề tài là loài Sargassum mcclurei được thu hái ở Hòn Chồng – Tp.Nha Trang.
Hình 2.1. Loài Sargassum mcclurei tại Hòn Chồng, Nha Trang, Khánh Hòa 2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định hàm ẩm
Mẫu được rửa sạch, cắt nhỏ, cân và sấy khô ở 1050C đến khối lượng không đổi.
2.2.2. Phương pháp định lượng hàm lượng phlorotannin tổng số [17]
Định lượng phlorotanin tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteu như mô tả bởi Singleton và cộng sự (1999) và dùng phloroglucinol xây dựng đường chuẩn. Cách tiến hành như phụ lục 2.
2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng [24]
Chống oxy hóa tổng được xác định theo phương pháp của Prieto (1999). Cách tiến hành như phụ lục 3.
2.2.5. Quy trình dự kiến chiết phlorotannin chống oxy hóa từ rong S. mcclurei
Hình 2.2. Quy trình dự kiến chiết xuất phlorotannin từ rong sargassum mcclurei
Giải thích quy trình
- Rong mơ tươi thu mẫu và định danh bởi chuyên gia phân loại học. - Rong sau khi thu được rửa sạch bằng nước biển nhằm loại bỏ tạp chất. - Khi về đến phòng thí nghiệm, rong được rửa cắt nhỏ, phơi sấy đến hàm ẩm 19% và bảo quản ở điều kiện khô ráo, không tiếp xúc ánh nắng mặt trời, nhằm hạn chế quá trình tổng hợp và chuyển hóa trong rong. Rong được bảo quản tốt hơn, đảm bảo cho quá trình thực hiện không gặp gián đoạn về vấn đề nguyên liệu.
Chọn thông số thích hợp - Hàm lượng phlorotannin - Hoạt tính chống oxy hóa tổng
Bã Lọc Cô đặc Cắt nhỏ Rong mơ Chiết Rửa
Mục đích của việc lựa chọn rong khô: hàm lượng ẩm trong rong nhỏ, góp phần quan trọng trong việc ức chế sự phát triển của vi sinh vật sống trên rong, ức chế quá trình tổng hợp và chuyển hóa trong rong. Từ đó rong được bảo quản tốt hơn, đảm bảo cho quá trình thực hiện không gặp gián đoạn về vấn đề nguyên liệu. Đồng thời, khi hàm lượng ẩm trong nguyên liệu giảm, tốc độ trích ly tăng lên vì nước tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán.
- Rửa sạch: Rong sẽ được rửa sạch nhằm loại bỏ tạp chất và muối bám dính trên rong, tạo điều kiện tốt cho quá trình chiết và lọc được thực hiện dễ dàng.
- Cắt nhỏ: Sau khi rửa sạch, rong được làm ráo sơ bộ rồi cắt hoặc băm nhỏ với kích thước thuận lời cho quá trình chiết rút. Làm nhỏ rong nhằm mục đích tăng diện tích tiếp xúc của rong nguyên liệu và dung môi, đồng thời làm phá vỡ cấu trúc tế bào rong, tạo điều kiện thuận lợi cho cấc chất hòa tan trong dung môi. Không nên xay hoặc nghiền rong quá nhỏ, bởi kích thước bột rong quá nhỏ sẽ bít lỗ của giấy lọc làm cản trở quá trình lọc.
- Công đoạn chiết: Các yếu tố như dung môi, tỷ lệ DM/NL, thời gian, nhiệt độ và pH dung môi chiết đều ảnh hưởng đến khả năng chiết rút phlorotannin. Vì vậy tại công đoạn này sẽ tiến hành các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trên đến khả năng chiết phlorotannin. Dự kiến chọn 5 dung môi có độ phân cực khác nhau là: ethanol, acetone, ethyl acetate, chloroform, n-hexan.
- Lọc: thu nhận dịch chiết có chứa hợp chất cần chiết, loại bỏ những tạp chất không tan khác(cặn, bã rong).
- Cô đặc nhằm loại bớt dung môi trong dịch lọc nhờ quá trình bay hơi dung môi bởi nhiệt và áp suất thấp. Trong quá trình cô đặc, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng, do nhiệt độ có thể gây biến tính. Vì vậy thực hiện cô đặc trong thiết bị cô quay chân không. Có thể giảm áp xuống thấp để nhiệt độ sôi của dung môi giảm xuống, tránh những tác dụng không có lợi đến phlorotannin.
2.2.6. Bố trí thí nghiệm
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm cần chú ý:
- Rong tránh tiếp xúc với ánh sáng mặt trời do phlorotannin dễ bị phân hủy. - Thường xuyên kiểm tra nhiệt độ trong quá trình chiết.
- Khi thời gian thí nghiệm kéo dài cần thường xuyên kiểm tra các điều kiện còn lại để đảm bảo độ chính xác.
2.2.6.1. Thí nghiệm ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết phlorotannin
Dung môi dùng để chiết xuất chất rất quan trọng, việc lựa chọn được dung môi thích hợp nhất sẽ thu được hiệu quả chiết xuất cao.
Mục đích: dung môi có ảnh hưởng đến chất cần chiết (như phân tích ở mục1.5.1) vì vậy thí nghiệm này nhằm chọn được dung môi thu được hàm lượng phlorotannin và có hoạt tính chống oxy hóa tổng cao.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết phlorotannin
- Hàm lượng phlorotannin - Hoạt tính chống oxy hóa tổng
Chọn dung môi thích hợp Lọc
Dịch chiết Chiết
Chloroform
Chọn tỷ lệ DM/NL thích hợp Chiết
10/1 20/1 30/1 40/1 50/1 60/1 70/1
- Hàm lượng phlorotannin - Hoạt tính chống oxy hóa tổng
Lọc
Dịch chiết
Cách thực hiện:
- Cho 10g rong đã chuẩn bị vào bình cầu nối ống sinh hàn, sau đó cho vào 200ml dung dịch ethanol 960. Lắp ống sinh hàn, cho vào bể ổn nhiệt để ổn định nhiệt độ chiết là 300C. Sau 24h lọc lấy dịch chiết. Xác định hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng.
- Tiến hành làm lần lượt với các dung môi. Cách làm tương tự như trên. Dựa vào kết quả xác định hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng, lựa chọn dung môi thích hợp nhất.
Sau khi chọn được loại dung môi thì tiến hành tiếp thí nghiệm: sử dụng dung môi ở những nồng độ khác nhau và tiến hành tiếp như trên.
2.2.6.2. Thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL đến khả năng chiết phlorotannin
Khi tiến hành chiết xuất cần phải lựa chọn tỷ lệ DM/NL sao cho phù hợp. Nếu tỷ lệ DM/NL thấp thì không chiết được hết phlorotannin. Nếu tỷ lệ DM/NL cao thì sẽ tốn kém dung môi và tốn năng lượng và thời gian hơn cho công đoạn sau.
Mục đích: lựa chọn tỷ lệ DM/NL phù hợp để thu được nhiều chất cần chiết và ít tốn dung môi.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NLđến khả năng chiết phlorotannin
Cách tiến hành
Cho 10g rong đã chuẩn bị vào bình cầu nối ống sinh hàn, cho dung môi đã chọn với tỷ lệ DM/NL khác nhau (hình 2.4). Lắp ống sinh hàn, cho vào bể ổn nhiệt để ổn định nhiệt độ chiết là 300C. Sau 24h ta lấy dịch chiết. Xác định hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng.
Dựa vào kết quả xác định hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng, lựa chọn tỷ lệ DM/NL thích hợp nhất.
2.2.6.3. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết phlorotannin
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất chất (mục 1.5.2.1), do đó cần xác định được nhiệt độ thích hợp nhất.
Mục đích: lựa chọn ra nhiệt độ thích hợp dựa trên điều kiện về dung môi dùng để chiết để thu được hiệu quả chiết cao nhất.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết phlorotannin
Chiết
Chọn nhiệt độ chiết thích hợp - Hàm lượng phlorotannin - Hoạt tính chống oxy hóa tổng
Lọc
Dịch chiết
Cách tiến hành:
Cho 10g rong đã chuẩn bị vào bình cầu nối ống sinh hàn, sau đó cho dung môi tỷ lệ DM/NL đã chọn ở thí nghiệm 2.5.2. Lắp ống sinh hàn, cho vào bể ổn nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau (hình 2.5). Sau 24h lọc lấy dịch chiết. Xác định hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng.
Dựa vào kết quả xác định hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng, lựa chọn nhiệt độ thích hợp nhất.
2.2.6.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đến khả năng chiết phlorotannin
Thời gian có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất. Nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết hết hoạt chất trong dược liệu; nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản. Do đó việc lựa chọn được thời gian chiết thích hợp sẽ có rất nhiều lợi ích.
Mục đích: Chọn được thời gian thích hợp cho hiệu quả chiết cao và không quá dài gây lẫn nhiều tạp chất.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đến khả năng chiết phlorotannin
Chọn thời gian chiết thích hợp - Hàm lượng phlorotannin
- Hoạt tính chống oxy hóa tổng Lọc
Dịch chiết
8 h 16 h 24 h 32 h 40 h 48 h 0,5 h 1 h 1,5h 2 h 2,5 h
Cách tiến hành
Cho 10g rong đã chuẩn bị vào bình cầu nối ống sinh hàn, cho dung môi vào với tỷ lệ DM/NL đã chọn. Lắp ống sinh hàn, cho vào bể ổn nhiệt để ổn định nhiệt độ chiết như đã chọn. Sau các khoảng thời gian như hình 2.6 lọc lấy dịch chiết. Xác định hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng.
Dựa vào kết quả xác định hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng, lựa chọn thời gian thích hợp nhất.
2.2.6.5. Thí nghiệm ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng chiết phlorotannin
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng chiết phlorotannin
Dịch chiết 1
Dịch chiết 2
Sử dụng số lần chiết thích hợp - Hàm lượng phlorotannin - Hoạt tính chống oxy hóa tổng
Chiết lần 1 Chiết lần 2 Chiết lần 3 Bã rong Dịch chiết 3 Bã rong
Cách tiến hành
Sau khi xác định được tỷ lệ DM/ NL, nhiệt độ và thời gian chiết thích hợp nhất, tiến hành chiết lần 1. Dịch chiết sau khi lọc được xác định hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng. Bã rong tiếp tục cho dung môi theo các điệu kiện như trên, thực hiện chiết lần 2. Tương tự, chiết lần 3.
2.2.6.6. Thí nghiệm ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng chiết phlorotannin
Mục đích: lựa chọn ra pH thích hợp dựa trên điều kiện về dung môi dùng để chiết để thu được hiệu quả cao nhất.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.8.Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng chiết phlorotannin
pH=6
Chọn pH dung môi thích hợp - Hàm lượng phlorotannin - Hoạt tính chống oxy hóa tổng
Lọc Dịch chiết pH=5 Chiết pH=7 pH=4 pH=3 pH=2 pH=8
Cách tiến hành
Cho 10g rong đã chuẩn bị vào bình cầu nối ống sinh hàn, cho dung môi vào với tỷ lệ NL/DM, nhiệt độ và thời gian đã chọn. Thay đổi pH dung môi từ 2÷8. Lắp ống sinh hàn, cho vào bể ổn nhiệt để ổn định nhiệt độ chiết. Sau đó lọc lấy dịch chiết. Xác định hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng.
Dựa vào kết quả xác định hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng, lựa chọn pH thích hợp nhất.
2.2.6.7. Xác định nhiệt độ cô đặc
Quá trình cô đặc là để tách dung môi có trong dịch chiết và thu được cao thô, nên cần xác định nhiệt độ cô đặc thích hợp nhằm hạn chế ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến phlorotannin.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.9. Xác định nhiệt độ cô đặc dịch chiết thu cao thô
Cách thực hiện:
Dịch chiết thu được sau khi đã lựa chọn được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: loại dung môi, tỷ lệ NL/DM, nhiệt độ, thời gian chiết và pH dung môi.
Chọn nhiệt độ cô đặc phù hợp - Hàm lượng phlorotannin - Hoạt tính chống oxy hóa tổng
500C
Cô đặc
Cô đặc trong thiết bị cô quay chân không với tốc độ vòng quay 35 vòng/ phút, ở các nhiệt độ khác nhau. Sau đó mang dịch đã cô đặc đi xác định hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng.
Dựa vào kết quả xác định hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng, lựa chọn thích hợp nhiệt độ cô đặc thích hợp nhất.
2.3. Hóa chất và thiết bị 2.3.1. Hóa chất
- Các hóa chất: Ethanol, acetone, ethyl acetate, chloroform, và n-hexan (Việt Nam), HCl (Trung Quốc) đều là hóa chất tinh khiết.
-Thuốc thử Folin- Ciocalteu gồm: sodium phosphate và amonium molybdate (Merck); NaCO3 7% (India); H2SO4 0,6M (Việt Nam).
2.3.2. Thiết bị
Sử dụng các thiết bị chủ yếu: Thiết bị hồi lưu ( ống sinh hàn, bình cầu), bể ổn nhiệt, cân phân tích, tủ sấy, bình hút ẩm, máy so màu UV- VIS, máy đo pH, ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong, phễu lọc, pipet hiện có tại các phòng thí nghiệm của trường.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm đều tiến hành 3 lần. Kết quả là trung bình giữa các lần thí nghiệm. Phân tích thống kê và hồi quy bằng phần mềm MS. Excell 2007.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định các thông số ảnh hưởng đến quá trình chiết phlorotannin 3.1.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết phlorotannin 3.1.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết phlorotannin
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm, mỗi mẫu lấy 10 g rong để nghiên cứu chiết rút phlorotannin bằng cách sử dụng các dung môi khác nhau. Mẫu 1: ethanol; Mẫu 2: acetone, Mẫu 3: ethyl acetat, Mẫu 4: chloroform, Mẫu 5: n-hexan. Sau khi chiết thu nhận phlorotannin để đánh giá khối lượng và hoạt tính chống oxy hóa tổng. Kết quả thể hiện ở hình 3.1, 3.2, 3.3 và bảng 3.1 (phụ lục 4).
Hình 3.1. Ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng phlorotannin
2.112 1.618 0.277 0.222 0.058 y = 0.139x2- 1.3844x + 3.4816 R² = 0.9342 0 0.5 1 1.5 2 2.5
Ethanol Aceton Ethyl acetate Chloroform n-hexan
H à m l ư ợ n g p h lo ro ta n n in (g /1 0 0 g r o n g ) Dung môi
Hình 3.2. Ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa tổng
Hình 3.3. Sự tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa tổng và hàm lượng phlorotannin 1.954 1.781 0.387 0.272 0.172 y = 0.1018x2- 1.118x + 3.1476 R² = 0.8845 0 0.5 1 1.5 2 2.5
Ethanol Aceton Ethyl acetate Chloroform n-hexan
H o ạ t tí n h c h ố n g o x y h ó a (g A A /1 0 0 g r o n g ) Dung môi y = -0.2818x2+ 1.5251x + 0.0118 R² = 0.9961 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 H o ạ t tí n h c h ố n g o x y h ó a (g A A / 1 0 0 g r o n g ) Hàm lượng phlorotannin (g/100 rong)
Nhận xét:
Qua kết quả nghiên cứu hình 3.1 và 3.2 thể hiện: khi chiết bằng 5 dung môi nói trên thì hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng thu được giảm dần theo thứ tự như sau: ethanol/ acetone /ethyl acetate / chloroform/ n-hexan. Điều này cho thấy những dung môi có độ phân cực mạnh hơn thì hàm lượng phlorotannin thu được và hoạt tính chống oxy hóa tổng cao hơn.
- Về hàm lượng phlorotannin:
Kết quả nghiên cứu hình 3.1 cho thấy: khi chiết bằng dung môi ethanol hàm lượng phlorotannin là cao nhất 2,112g/100g rong. Trong khi đó hàm lượng phlorotannin thu được thấp nhất khi sử dụng n-hexan 0,058g/100g rong. Acetone cũng là dung môi chiết được phlorotannin với hàm lượng khá cao 1,618g/100g rong. Có thể giải thích những điều trên như sau:
+ Độ phân cực của dung môi và hợp chất tự nhiên là rất quan trọng trong chiết xuất. Dung môi phân cực thì sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực. Theo tài liệu [27] cho thấy các hợp chất phenol thường dễ dàng hòa tan trong dung môi phân cực nhỏ hơn so với nước. Phlorotannin là hợp chất có độ phân cực do đó hiệu quả