2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.4. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích
Trong phân tích định lượng, để có kết quả phân tích đáng tin cậy thì phương pháp phân tích sử dụng phải đảm bảo độ tin cậy. Độ tin cậy của phương pháp phân tích được đánh giá thông qua việc xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và xác định độ không đảm bảo đo.
a) Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích
Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp (Method Validation) là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đ đảm bảo độ tin cậy, đáp ứng được các yêu cầu đặt ra [63, 64].
42
Một số thuật ngữ và định nghĩa sử dụng trong tài liệu này được trích dẫn từ TCVN 6910-4: 2001 (ISO 5725-4 : 1994), một số hướng dẫn của AOAC và Euracchem [65, 66, 67].
Giá trị quy chiếu được chấp nhận (accepted reference value): Giá trị được chấp nhận làm mốc để so sánh (giá trị lý thuyết, nồng độ mẫu chuẩn của một số tổ chức quốc gia/ quốc tế nhận, giá trị trung bình,…)
Độ chính xác (accuracy): Mức độ gần nhau giữa kết quả thử nghiệm và giá trị quy chiếu được chấp nhận
Độ đúng (trueness): Mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của một dãy lớn các kết quả thử nghiệm và giá trị quy chiếu được chấp nhận.
Độ chệch (bias): Mức độ sai khác giữa kỳ vọng của các kết quả thử nghiệm và giá trị quy chiếu được chấp nhận.
Độ chụm (precision): Mức độ gần nhau giữa các kết quả thử nghiệm độc lập nhận được trong điều kiện quy định.
Độ lặp lại (repeatability): độ lặp là phép đo sự biến đổi của các kết quả đo trong thời gian ngắn. Độ lặp lại là độ chụm của các kết quả được đo dưới điều kiện cùng phương pháp, cùng vật liệu thử nghiệm, cùng phòng thí nghiệm, cùng người thực hiện, trong thời gian ngắn.
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đ c sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.
Phương pháp xác định một số thông số khi thực hiện xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích được thực hiện theo hướng dẫn của Euracchem [68, 69] cụ thể như sau:
(1) Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của thiết bị - Độ ổn định của tín hiệu phân tích được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn của tín hiệu đo các dung dịch chuẩn khi bơm lặp lại.
- Giới hạn phát hiện (IDL) và giới hạn định lượng (IQL) của thiết bị:
Xác định tỷ lệ tín hiệu và nhiễu đường nền đối với mẫu đo c nồng độ thấp (S/N = Signal to noise ratio), trong đ : S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền. Tính độ lệch chuẩn SD của tỷ lệ S/N; IDL = SD;
IQL = 3SD.
43
(2) Xác định khoảng tuyến tính và phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn.
Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo tín hiệu các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi (tối thiểu 6 điểm chuẩn, mỗi điểm chuẩn đo lặp ít nhất 2 lần, lấy giá trị trung bình của tín hiệu) rồi khảo sát sự phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, tính toán để đánh giá sự phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ cho đến khi không còn tuyến tính. Để đánh giá sự phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ là tuyến tính, cần thực hiện các đánh giá sau:
+ Đánh giá hệ số tương quan hồi quy R: Chỉ tiêu đầu tiên để đánh giá sự phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ là tuyến tính là R phải đạt theo yêu cầu sau:
0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1.
Tuy nhiên, việc sử dụng hệ số tương quan hồi quy R chưa đủ để đánh giá phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ là tuyến tính, cần phải sử dụng thêm các đại lượng thống kê để đánh giá [70, 71]. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã thực hiện đánh giá Thông qua hệ số chất lượng QC (quality coefficient) và chuẩn Mandel.
+ Đánh giá thông qua hệ số chất lượng QC [70, 72, 73]:
√∑
̂
̅
(2.1)
Trong đ :
̅: là giá trị trung bình của các giá trị y
̂là giá trị tính dựa vào đường hồi quy và giá trị x df = n-2 (với n là số điểm chuẩn)
Giới hạn chấp nhận đối với mối tương quan hồi quy tuyến tính giữa tín hiệu và nồng độ là QC < 5% .
+ Đánh giá dạng phù hợp của phương trình hồi quy theo chuẩn thống kê Mandel ̂ [70, 74, 75].
̂
(2.2)
44
Trong đ : Sx,y và Sx,y,2 được xác định theo công thức:
√∑ ̂ (2.3) Sx,y được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất của tập số liệu, Sx,y,2 được tính theo phương trình hồi quy bậc 2
df là bậc tự do (df = n - 2 với phương trình hồi quy tuyến tính bậc 1, df = n-3 với phương trình hồi quy bậc 2).
Giá trị tính ̂ được so với giá trị tra bảng F (99%, df1 = 1, df2 = n-3), nếu ̂ nhỏ hơn giá trị tra bảng thì mối tương quan giữa x và y tuân theo phương trình hồi quy tuyến tính bậc 1.
(3) Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phương pháp
Các thí nghiệm xác định LOD được tiến hành trên nền môi trường đã khảo sát có nồng độ thấp. Thực hiện phân tích 10 lần song song và tính kết quả
(2.4) √∑( ) (2.5) Trong đ :
Xi : Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ i;
: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm;
độ lệch chuẩn của kết quả thử nghiệm, n là số lần thí nghiệm lặp Tiếp theo, đánh giá giá trị LOD xác định được thông qua hệ số R theo công thức:
- Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ mẫu thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy;
- Nếu R < 4 thì phải dùng mẫu thử có nồng độ cao hơn, hoặc thêm một lượng nhỏ chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng, làm lại thí nghiệm và tính lại R - Nếu R > 10 thì phải dùng mẫu thử có nồng độ nhỏ hơn, hoặc pha loãng mẫu thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R
45
Việc bố trí thí nghiệm để xác định LOQ sẽ kết hợp với tính LOD. Giá trị LOD với thí nghiệm trên nền mẫu môi trường được tính theo công thức:
LOQ = 10xSD (2.6) (4) Độ chính xác của phương pháp
Độ chính xác của phương pháp được đánh giá thông qua hai thành phần là độ chụm và độ đúng. Trong nghiên cứu này, độ chụm được sử dụng là độ lặp lại (repeatability).
Cách xác định độ lặp: Tiến hành làm thí nghiệm lặp lại 10 lần (ít nhất 6 lần) trên cùng nền mẫu trắng có thêm chuẩn (mỗi lần bắt đầu từ cân mẫu). Tính độ lệch chuẩn SD theo công thức (2.4) và độ lệch chuẩn tương đối RSD.
(2.7) Giá trị của RSD% được đánh giá theo quy định của AOAC (phụ lục 4).
Cách xác định độ đúng: Giống như độ chụm, độ đúng là một khái niệm định tính. Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thực không thể biết một cách chính xác, tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu được chấp nhận (gọi chung là giá trị đúng).
Muốn xác định được độ đúng cần phải tìm được giá trị đúng, c 3 cách khác nhau để xác định độ đúng bao gồm: so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả thực hiện bởi một phương pháp đối chiếu, hoặc sử dụng mẫu đã biết nồng độ (mẫu kiểm tra hoặc mẫu chuẩn được chứng nhận - CMR), hoặc xác định độ thu hồi.
Trong nghiên cứu này:
- Mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM) sử dụng để đánh giá độ đúng của quy trình xác định hàm lượng tổng thủy ngân bằng phương pháp CV-AAS
- Với các quy trình còn lại, chúng tôi sử dụng phương pháp đánh độ đúng thông qua xác định độ thu hồi.
Cách xác định độ thu hồi:
46
Phân tích lặp trên 6 lần trên nền mẫu môi trường thêm chuẩn bằng phương pháp khảo sát ở ba mức nồng độ thấp, cao, trung bình so với giá trị giới hạn trong các tài liệu. Tính độ thu hồi theo công thức sau đây:
- Đối với mẫu thử:
(2.8) Trong đ :
R%: Độ thu hồi, %
Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
Sau đ tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại. Sử dụng chuẩn so sánh của AOAC (phụ lục 4) để đánh giá độ thu hồi.
b) Xác định độ không đảm bảo đo của phương pháp
Khái niệm
Độ không đảm bảo đo (KĐBĐ) của phép đo (phương pháp phân tích) là thông số gắn với kết quả của phép đo, thông số này đặc trưng cho mức độ phân tán của các giá trị có thể chấp nhận được quy cho đại lượng đo của phép đo.
Các nguồn gây ra độ KĐBĐ
Trong một phép thử có rất nhiều nguồn gây ra độ không đảm bảo đo, một số nguồn cơ bản có thể kể đến là: mẫu thử, hoạt động lấy mẫu, nền mẫu điều kiện bảo quản, quá trình xử lý mẫu, dung môi và thuốc thử, thiết bị, con người, ...và các nguồn ngẫu nhiên khác.
Có nhiều cách đánh giá độ không đảm bảo đo, tuy nhiên ở Việt Nam thường phổ biến sử dụng các ước lượng độ không đảm bảo đo theo hướng dẫn của Eurachem.
Cách tiến hành
Bước 1: Ước lượng độ KĐBĐ thành phần, gồm hai thành phần chính là khả năng tái lặp của phòng thí nghiệm (URw) và độ thu hồi của phương pháp
47
Ước lượng độ KĐBĐ từ khả năng tái lặp trong phòng thí nghiệm (URw) + Sử dụng mẫu chuẩn từ dung dịch chuẩn (mẫu QC): Tiến hành phân tích lặp lại tối thiểu 20 lần mẫu chuẩn (mẫu trầm tích sạch thêm chuẩn).
Sau đ tính độ KĐBĐ của mẫu chuẩn theo công thức:
(2.9)
Trong đ : URw, standard: độ KĐBĐ của mẫu chuẩn; SD: độ lệch chuẩn; TB:
giỏ trị hàm lượng trung bỡnh của mẫu chuẩn (ng/g hoặc àg/g).
+ Tiến hành phân tích tối thiểu 10 mẫu môi trường với các nền mẫu khác nhau, mỗi mẫu lặp lại 2 lần. Tính giá trị trung bình của mỗi mẫu, tính sai số thực nghiệm của các lần lặp lại của các mẫu, tính phần trăm sai khác (RPD).
Sau đ tính độ KĐBĐ của mẫu môi trường theo công thức:
(2.10) Từ dữ liệu thực nghiệm của mẫu chuẩn và mẫu môi trường, ước lượng được độ KĐBĐ URW từ khả năng tái lặp của PTN theo công thức sau:
√ (2.11)
Ước lượng độ KĐBĐ từ độ thu hồi thực nghiệm của phòng thí nghiệm Công thức xác định độ KĐBĐ từ độ thu hồi thực nghiệm
√ (2.12) Trong đ :
√∑ (2.12) Ubias: độ KĐBĐ từ sai số của phòng thí nghiệm
RMSbias: được tính toán từ sai số trong phòng thí nghiệm thông qua giá trị độ thu hồi của mẫu thêm chuẩn.
Uadd: sai số từ hóa chất, dụng cụ thủy tinh. Sai số này rất nhỏ so với giá trị của Ubias nên coi Uadd = 0
Bias: sai khác của độ thu hồi trung bình so với 100%
48 nη: số mức nồng độ thêm chuẩn
Bước 2: Ước lượng độ KĐBĐ tổng hợp từ các thành phần Độ không đảm bảo đo tổng hợp được tính theo công thức sau:
√ (2.13) Bước 3: Ước lượng độ KĐBĐ mở rộng
Độ không đảm bảo đo mở rộng được tính theo công thức sau:
(2.14) Trong đ , hệ số phủ k chỉ ra mức độ tin cậy của độ KĐBĐ. Thông thường, k =2 để chỉ mức độ tin cậy của giá trị u là 95%, k còn có các giá trị 1;
2,58; 3 với các mức độ tin cậy của u khác nhau. Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn k = 2.
c) Biểu diễn độ không đảm bảo đo
+ Cách viết độ không đảm bảo đo chuẩn tổng hợp:
Kết quả (đơn vị) với độ không đảm bảo đo chuẩn U (đơn vị) Chú ý: Không sử dụng dấu “±” khi báo cáo độ không đảm bảo đo chuẩn vì dấu này thường gắn với độ tin cậy cao như 95% và 99%.
+ Cách viết độ không đảm bảo đo mở rộng
Thông thường, độ không đảm bảo đo mở rộng với hệ số phủ k = 2 được viết như sau: