Acetylcholinesterase đƣợc phát hiện trong nhiều cơ thể sinh vật từ bậc thấp tới bậc cao như nhuyễn thể, sò, cá, ngan, gà, thỏ, chuột, ngựa, bò...và ở người [39, 60, 82]. Trong cơ thể, AChE không chỉ có ở mô thần kinh mà còn có ở các mô khác nhƣ: mô cơ,...và trong huyết thanh, hồng cầu [10].
Do có nhiều ứng dụng trong đời sống, trên thế giới, AChE đƣợc nghiên cứu tách chiết từ rất sớm. Để đạt đƣợc độ tinh sạch và hoạt độ phù hợp cho các mục đích khác nhau, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu tinh sạch enzyme từ các
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
nguồn khác nhau. Các phương pháp tinh sạch đều dựa trên cơ sở tách chiết protein.
Một trong các phương pháp thông dụng nhất là sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn protein nhằm thu đƣợc chế phẩm enzyme thô, sau đó sử dụng sắc ký để tinh sạch loại enzyme mong muốn [27]. Chế phẩm enzyme có độ sạch cao đƣợc thu nhận từ các nguồn khác nhau và đã có chế phẩm bán trên thị trường. Ban đầu, enzyme AChE đƣợc tách chiết từ một số loài cá nhƣ cá đuối điện Porpedo marmorata [19], cá chình điện Electrophorus electricus [76]. Hiện nay AChE dạng hòa tan ở chuột đã được tinh sạch bởi phương pháp sắc ký ái lực sử dụng trimethylamineophenyl liên kết với Sepharose thông qua axit succinic và diaminodipropylamine và có hoạt độ riêng là 2,2 U/mg [50, 76].
Sử dụng sắc ký ái lực trong tinh sạch AChE từ gan cừu với cột concanavalin A-Sepharose 4B và cột edrophonium Sepharose 6B. Kết quả tinh sạch thu đƣợc chế phẩm AChE có một hoạt độ riêng là 21 U/mg với độ sạch 842 lần [44]. AChE từ Channa micropeltes cũng đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực trên procainamide–Sephacryl S-1000. Chế phẩm AChE thu đƣợc có hoạt độ riêng là 793,6 U/mg hiệu suất 91,12% [53]. Cũng bằng sắc ký ái lực, AChE từ Puntius javanicus đƣợc tinh sạch có hoạt độ riêng 1,92 U/mg, độ sạch 8,48 lần. Ji YS và tập thể đã tinh sạch AChE ở não chim cút Nhật Bản bằng sắc ký ái lực trên concanavalin A-Sepharose và edrophonium-Sepharose. Chế phẩm thu đƣợc có hoạt độ riêng là 2500 U/mg protein với độ sạch tăng 10416 lần [41].
Một trong những phương pháp tinh sạch AChE được sử dụng nhiều nhất là tinh sạch bằng sắc ký lọc gel Sephadex kết hợp với sắc ký trao đổi ion DEAE- cellulose. AChE từ Oreochromis aurea hay AChE từ mầm đậu cô ve (P. Vulgaris) đƣợc tinh sạch bằng sắc ký lọc gel có hoạt độ riêng lần lƣợt là 20,6 U/mg và 31,5 U/mg độ sạch tương ứng tăng là 139 lần và 39,3 lần [78, 81]. Tinh sạch AChE ở các phần khác nhau của ấu trùng Philosamia ricini bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-100 thu đƣợc chế phẩm AChE ở phần đầu có hoạt độ riêng cao nhất là 16,2 ± 0,2 U/mg [4]. AChE từ não thỏ đƣợc tinh chế qua sắc ký cột sephadex G - 50 và sắc ký trao
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
đổi ion qua cột CM-cellulose có hoạt độ riêng là 5 U/mg với độ sạch 166 lần [51].
Tinh sạch AChE từ hồng cầu người sử dụng 9-amino-1,2,3,4-tetrahydroacridine thu đƣợc với hiệu suất 23,5%, với hoạt độ riêng là 9,2 EU/mg (endotoxin units/mg protein) [33].
Gần đây, AChE thu nhận từ cá điện và hồng cầu người được tinh sạch bằng sắc ký ái lực và kỹ thuật DNA tái tổ hợp nên chế phẩm enzyme thu đƣợc có hoạt độ riêng rất cao. Ở Isarel, bằng cách sử dụng phối hợp sắc ký trao đổi ion và sắc ký ái lực, Fisher và cộng sự đã thu được chế phẩm AChE ở hồng cầu người có hoạt độ riêng 4572 U/mg [29].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu tinh sạch enzyme Acetylcholinesterase ở Việt Nam AChE bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1960 ở Trường Đại học Y Hà Nội, Học viện Quân y 103 và một số đơn vị nghiên cứu khoa học khác. Kết quả nghiên cứu của các cơ sở này mới chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát ảnh hưởng của các loại hóa chất, độc tố tới hoạt độ của AChE lên động vật và con người. Dựa vào sự thay đổi hoạt độ AChE trong máu để chẩn đoán một số bệnh về gan và nhiễm độc thuốc trừ sâu [2].
Bộ thuốc thử KIT-B, KIT-BM đã đƣợc Binh chủng Hóa học – Bộ Quốc Phòng tổ chức nghiên cứu chế thử và thử nghiệm. Hiện nay, bộ thuốc thử này đã được sản xuất để thay thế bộ thuốc thử của Liên bang Nga nhờ có tính năng tương đương. Một thành phần quan trọng trong bộ thuốc thử này chính là enzyme cholinesterase (ChE).
Viện Hóa học – Môi trường Quân sự bắt đầu đi vào nghiên cứu ChE với mục đích khảo sát nguồn nguyên liệu, xác lập quy trình tách chiết ChE tạo chế phẩm phục vụ cho việc phòng chống chiến tranh hóa học. Kết quả bước đầu trong các công bố đã xác lập đƣợc quy trình xác định hoạt độ ChE và quy trình tách chiết enzyme này ở dạng đông khô từ huyết thanh ngựa, chế phẩm thu đƣợc có hoạt tính xấp xỉ 130 U/mg protein. Tuy nhiên quy trình tách chiết này rất phức tạp và hiệu suất thu hồi ChE là chƣa cao, vì vậy việc sản xuất các kit thử nói trên còn gặp nhiều
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
khó khăn [1].
Tác giả Lê Minh Trí đã tiến hành tinh sạch AChE từ huyết thanh của ngan và ốc bươu vàng bằng phương pháp sắc ký cột CM - cellulose và sắc ký cột DEAE - cellulose, bước đầu đã xác định được hoạt độ của AChE ở huyết thanh ngan là 1402,72 U/l và ở ốc bươu vàng là 686 ± 5 U/g [2, 3].
Ở Việt Nam, nhìn chung chƣa có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất AChE. Các công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc tách enzyme này từ các nguồn tự nhiên, khảo sát các tính chất lý-hóa và hoạt tính sinh học của chúng.
Ngoài ra, việc sử dụng AChE ở Việt Nam vẫn còn hạn chế do nguồn cung chƣa đủ và thiếu ổn định.
Việc tách chiết ChE bằng các quy trình khác nhau đều có những hạn chế nhất định về hiệu suất, hoạt độ riêng và đặc biệt là việc sử dụng các phương pháp hiện đại rất khó có thể tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm ở nước ta hiện nay. Ngoài ra, việc tinh sạch AChE từ tự nhiên có những nhƣợc điểm nhƣ sau:
+ Độ ổn định thấp, phụ thuộc nhiều vào nguồn nguyên liệu.
+ Khó sản xuất với quy mô lớn đo hiệu suất thấp và không chủ động nguồn nguyên liệu.
+ Quy trình phức tạp qua nhiều giai đoạn do đó enzyme thường bị mất hoạt tính cũng như bị mất qua các bước tinh sạch.