3.2. Tinh sạch enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò
3.2.2. Tinh sạch enzyme Acetylcholinesterase qua cột Sephadex TM G-75
Để tiếp tục tinh sạch AChE của hồng cầu bò, tiến hành tập trung các phân đoạn có hoạt độ AChE sau khi qua cột DEAE - sepharose, cô đặc mẫu bằng màng cô mẫu và cho sắc ký qua cột lọc gel SephadexTM G-75. Kết quả đƣợc trình bày trên hình 3.3.
Hình 3.3. Sắc ký đồ lọc gel qua cột Sephadex G75 để tinh sạch AChE từ hồng cầu bò Hàm lƣợng protein trong các phân đoạn rửa chiết (mgPr/ml)
Hoạt độ riêng AChE trong các phân đoạn rửa chiết (U/mg)
Kết quả ở hình 3.3 cho thấy sắc ký đồ có ba đỉnh protein trải rộng từ phân đoạn 38 đến phân đoạn 59. Hoạt độ AChE cũng xuất hiện với một đỉnh duy nhất trùng với đỉnh protein thứ nhất từ phân đoạn 39 đến phân đoạn 42 (tương ứng với 8 ml thể tích rửa chiết). Tổng lượng protein và hoạt độ AChE của phần này tương ứng là 3,12 mg protein và 387 U. Qua bước sắc ký lọc gel có thể nhận thấy rằng sử dụng
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
sắc ký lọc gel SephadexTM G-75 đã cho phép loại bỏ đƣợc 70,3% protein không mong muốn trong chế phẩm đã qua cột DEAE - sepharose. Đồng thời hoạt độ riêng của chế phẩm AChE sau khi qua bước này đã tăng lên 13,5 lần so với ban đầu. Kết quả thu được qua các bước tinh sạch AChE từ hồng cầu bò được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1.Tóm tắt kết quả thu được qua các bước tinh sạch AChE từ hồng cầu bò Các bước tinh
sạch
Protein tổng số (mg)
Hoạt độ tổng số (U)
Hoạt độ riêng (U/mgpr)
Độ sạch
Hiệu suất (%)
Dịch thô 292 2686,4 9,2 1,0 100
Qua cột DEAE-
sepharose 10,5 676,8 64,6 7,02 25,2
Qua cột
Sephadex G75 3,12 387 124 13,47 14,4
Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy qua 2 bước tinh sạch từ hồng cầu bò thu đƣợc dịch chiết có chứa AChE có hoạt độ và độ tinh sạch khá cao. Có thể so sánh với một số nghiên cứu khác nhƣ sau:
Đối với trong nước, hiện đã có một số công trình nghiên cứu tách chiết và tinh sạch AChE từ các nguồn khác nhau. Theo tài liệu [3] AChE đã đƣợc tách chiết từ ốc bươu vàng và tinh sạch qua hai bước: bước thứ nhất là kết tủa bằng tác ethanol, aceton và muối amoni sunfat; bước thứ hai là chạy sắc ký trao đổi ion cột DEAE-cellulose. Kết quả tinh sạch thu đƣợc các phân đoạn 22 và 23 có hoạt độ cao nhất là 1,83 U/mg. Theo tài liệu [1] BuChE từ huyết thanh ngựa cũng đã đƣợc tinh sạch qua hai giai đoạn: kết tủa phân đoạn bằng muối amonisunphat (3 bước) và sử dụng sắc ký trao đổi ion với loại nhựa trao đổi là DEAE Sepharose fast flow trong các điều kiện khác nhau (2 bước). Kết quả đã tạo ra được chế phẩm BChE có hoạt độ riêng đạt 150 U/mg và có độ sạch gấp 2941 lần so với nguyên liệu đầu vào.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Trên thế giới, tinh sạch AChE được thực hiện theo nhiều phương pháp khác nhau [5, 36, 62], AChE đã được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực phối tử ức chế là kháng thể cố định [42, 45, 75] procainamide, tacrine, methylaminophenylamine và những kháng thể đặc hiệu methylacridine [20] từ tế bào sợi ở phổi người nối với giá thể là Sepharose 6 CNBr-Sepharose [42]. Ngoài ra, AChE cũng đã đƣợc tinh sạch bằng cách giữ lại trên cột ái lực và đẩy ra bằng procainamide, sau đó đƣợc phân tách tiếp bằng sắc ký trao đổi ion [45, 75] (Bảng 3.2)
Bảng 3.2. Một số kết quả nghiên cứu tinh sạch enzyme AChE STT Đối tƣợng tinh
sạch
Phương pháp tinh sạch
Hoạt độ AChE (U/mg)
Độ sạch Hiệu suất (%)
1 Màng hồng cầu người [33]
Sắc ký ái lực 9,22 685 23,5
2 Chuột [50, 76] Sắc ký ái lực 2,206 Không xác định
60-92
3 Gan cừu [11] Sắc ký ái lực 21 842 Không xác
định 4 Não Oreochromis
aurea [81]
Sắc ký ái lực 20,6 139 22,1
5 Pardosa astrigera [52]
Sắc ký trao đổi ion và lọc gel
24,11 229,6 13,88
6 Thí nghiệm của nhóm nghiên cứu
Sắc ký trao đổi ion và lọc gel
124 13,47 14,4
Ngoài ra, AChE từ cá đuối điện, hồng cầu bò và từ lươn đã được tinh sạch nhờ sự liên kết đặc hiệu với tacrine đã đƣợc tổng hợp trên giá thể epoxy-activated Sepharose 6B [20]. AChE đƣợc tinh sạch với hiệu suất 59% đối với hồng cầu bò, 27-60% đối với cơ quan của cá đuối điện và >92% đối với hai nguồn AChE thương
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
mại từ lươn. AChE từ lươn có nguồn gốc thương mại bao gồm 2 loại protein với khối lượng phân tử là 80 và 55 kDa. Trong khi đó một nguồn AChE thương mại khác từ lươn bao gồm 2 protein 55 và 25 kDa. Bên cạnh đó, AChE tinh sạch được từ bò chỉ có một loại protein có khối lƣợng phân tử là 80kDa.
Như vậy có thể thấy, bằng các phương pháp tách chiết và tinh sạch khác nhau thì AChE thu đƣợc từ hồng cầu bò là cao hơn rất nhiều so với các nguồn nguyên liệu khác. Bên cạnh đó hồng cầu bò là loại nguyên liệu rẻ tiền, dễ thu mua, thuận lợi để sản xuất AChE trên quy mô lớn.