CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp tinh sạch enzyme acetylcholinesterase
2.2.3.1. Tách chiết enzyme acetylcholinesterase từ máu sinh vật
Mẫu máu đƣợc ủ với lysozyme trong 10 phút ở 37oC. Sau đó, mẫu máu đƣợc ly tâm 12000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC để thu dịch nổi có chứa AChE. Dịch nổi sau khi ly tâm tiếp tục đƣợc lọc qua màng cut-off 0,45 nm.
2.2.3.2. Phương pháp sắc ký trao đổi ion: DEAE – Sepharose
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Gel DEAE - sepharose được nhồi vào cột (kích thước 3,8 x 15 cm) đến thể tích 50ml. Cột gel đƣợc cân bằng bằng 200 ml đệm phosphate 0,02 M, pH 8 (đệm B).
50 ml dịch chiết chứa AChE (pha loãng 10 lần) đƣợc đƣa về cùng điều kiện pH 8 và đƣợc cho từ từ lên cột (2 lần). Sau khi cho dịch chiết chảy qua, cột đƣợc rửa bằng đệm B và đƣợc đẩy bằng gradien NaCl từ 20 – 1000mM pha trong đệm B. Tiếp theo, các phân đoạn protein được thu, mỗi phân đoạn 2 ml. Bước cuối cùng, phần dịch không hấp thụ và các phân đoạn thu đƣợc đƣợc phân tích protein và kiểm tra hoạt tính AChE. Những phân đoạn có hoạt độ riêng AChE cao tiếp tục đƣợc cho qua cột sắc ký lọc gel SephadexTM G-75.
2.2.3.3. Phương pháp sắc ký lọc gel SephadexTM G-75
Gel SephadexTM G-75 được hút từ từ vào cột (kích thước 1 x 80 cm) đến thể tích 50 ml. Tiếp theo cột đƣợc cân bằng bằng 150 ml đệm B. Các phân đoạn chứa AChE đã qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE – sepharose đƣợc cho chảy qua.
Sau đó, cột đƣợc rửa bằng đệm B và thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml. Các phân đoạn đƣợc phân tích protein và kiểm tra hoạt độ AChE.
2.2.4. Đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm thu được bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) của Laemmli (1970).
Gel polyacrylamide hai lớp, trong đó gel cô là 4% và gel tách là 12%, với tỉ lệ các thành phần nhƣ sau:
Gel tách (12%):
- Dung dịch acrylamide 30% 1875 àl
- 4x Tris HCl/SDS pH 8,8 938 àl
- H2O cất 938 àl
- APS 10% 30 àl
- TEMED 7 àl
Gel cô (4%):
- Dung dịch acrylamide 30% 163 àl
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
- 4x Tris HCl/SDS pH 6,8 313 àl
- H2O cất 763 àl
- APS 10% 20 àl
- TEMED 5 àl
Ngay sau khi bổ sung APS và TEMED, hỗn hợp đƣợc trộn đều và đúc vào khuôn kính đã đƣợc gắn sẵn trên giá đỡ. Sau khi phần gel tách đƣợc trùng hợp hoàn toàn, tiếp tục đúc phần gel cô và để gel trùng hợp hoàn toàn sau 30 phút mới sử dụng cho mục đích điện di.
Mẫu protein sau khi trộn với đệm mẫu (nồng độ 4x) theo tỷ lệ thể tích 3:1 đƣợc xử lý nhiệt ở 95oC trong 5 phút và làm lạnh ngay trên đá. Mẫu đƣợc tra vào giếng. Điện di trong đệm Tris-glycine pH 8,8 chứa SDS 1% với điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho tới khi vạch màu chỉ thị (bromophenol xanh) cách đáy bản gel 0,5 cm thì dừng lại. Bản gel điện di đƣợc nhuộm với dung dịch CBB (coomassie blue brillant) 0,5% pha trong hỗn hợp methanol: acetic: nước với tỉ lệ thể tích là 3:6:1 khoảng 20 phút. Tiến hành tẩy gel bằng hỗn hợp đã dùng để pha CBB cho tới khi bản gel có nền sáng.
2.2.5. Phương pháp đông khô
Các phân đoạn tinh sạch AChE bằng phương pháp sắc ký lọc gel SephadexTM G-75 đƣợc dồn lại vào các cốc 150 ml để ở -20oC trong 12h. Tiếp theo, các cốc đƣợc lắp vào máy đông khô, chọn chế độ đông khô ở điều kiện nhiệt độ bình thu -400C và áp suất bình thu 0,1mBar. Sau 24h thu đƣợc chế phẩm enzyme AChE dạng bột.
2.2.6. Nghiên cứu một số tính chất của enzyme acetylcholinesterase
Sau khi đã thu đƣợc AChE tinh sạch, tiến hành nghiên cứu tính chất của AChE trong một số điều kiện pH, nhiệt độ khác nhau với mục đích nhằm tối ƣu môi trường phản ứng và điều kiện bảo quản của AChE.
2.2.6.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của AChE
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
16 mg cơ chất acetylthiocholine iodide đƣợc pha trong 40 ml axit xanh (hỗn hợp chất sinh màu và cơ chất). Tiếp theo, 0,05 ml dịch chiết chứa AChE đƣợc bổ sung vào 2,5 ml hỗn hợp chất sinh màu và cơ chất. Điều kiện nhiệt độ phản ứng đƣợc thay đổi khác nhau (từ 20oC đến 70oC) theo các bậc thay đổi là 5oC trong 30 phút. Hoạt độ của AChE được xác định theo phương pháp trình bày trong mục 2.2.2.2.
2.2.6.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của AChE
1,38 g axit xanh đƣợc pha trong 40 ml đệm phosphate 0,02M có pH khác nhau (từ 5 đến 10) theo các bậc thay đổi là 0,5, đƣợc điều chỉnh bằng dung dịch NaOH, HCl. Tiếp theo, 16 mg cơ chất acetylthiocholine iodide đƣợc bổ sung vào dung dịch trên. Sau đó, 0,05 ml dịch chiết chứa AChE đƣợc bổ sung vào 2,5 ml hỗn hợp cơ chất và chất sinh màu. Hoạt độ của AChE được xác định theo phương pháp trình bày trong mục 2.2.2.2.
2.2.7. Phương pháp tách chiết mRNA tổng số
Trong nghiên cứu này RNA được tách và tinh sạch từ các mẫu máu bò theo kit của Qiagen. Quy trình thực hiện như sau:
Dịch chiết mỏu bũ (400 àl) đó đƣợc tỏch sẵn từ mỏu tổng số đƣợc chuyển sang ống eppendorf, 400 àl dung dịch đệm phosphate chứa muối (PBS) và 640 àl đệm AC, 0,56 àl dung dịch chất mang RNA (RNA carrier) đƣợc bổ sung nhằm tăng khả năng gắn RNA virus, hỗn hợp đƣợc trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút.
Mẫu sau đó đƣợc ly tâm ở 3.000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ dịch nổi. Kết tủa đƣợc hoà tan trở lại trong 240 àl đệm AR đó đƣợc làm núng tới 60oC, 16 àl proteinase K đƣợc bổ sung, hỗn hợp đƣợc trộn đều trờn mỏy vortex 3-5 lần, mỗi lần 5-10 giây. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc ủ tiếp ở 40oC trong 10 phút và lắc đều cứ sau 5 phỳt 1 lần. 240 àl đệm AB đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và trộn đều bằng máy vortex. Sau đó, hỗn hợp đƣợc đƣa vào cột QIAamp Spin và đƣợc ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Cột sau đó đƣợc chuyển sang ống eppendorf mới và đƣợc rửa 2 lần bằng đệm AW1 và AW2 kết hợp ly tâm ở 14.000
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
vòng/phút trong 3 phút. Cuối cùng, cột đƣợc chuyển sang một ống eppendorf mới.
60 àl đệm AVE đƣợc bổ sung, hỗn hợp đƣợc ly tõm ở 10.000 vũng/phỳt trong 1 phút để thu hồi lại RNA. Mẫu đƣợc bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng.
2.2.8. Phương pháp tổng hợp cDNA
RNA của máu bò đƣợc chuyển thành cDNA bằng enzyme M-MLV reverse transcriptase của hãng Enzynomics. cDNA đƣợc tổng hợp theo quy trình: 10
l RNA của máu bò và 1 l mồi ngẫu nhiên (0,2 g) đƣợc biến tính ở 70oC trong 5 phút, làm lạnh trên đá. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc bổ sung 2 l đệm M-MLV reverse transcriptase 10x, 2,5 l dNTPs 2 mM, 3,5 l H2O, 0,5 àl chất ức chế ribonuclease và 0,5 l M-MLV reverse transcriptase rồi ủ ở 37oC trong 90 phút.
Phản ứng đƣợc kết thúc bằng xử lý nhiệt ở 70oC trong 10 phút và làm lạnh trên đá.
Các mẫu cDNA đƣợc bảo quản ở -20oC để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.9. Phương pháp PCR
Mỗi phản ứng PCR (25 l) chứa các thành phần dưới đây:
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích
Đệm Taq DNA polymerase 10X 2,5 l Taq DNA polymerase 0,5 l
dNTPs 2mM 2,5 l
AChE Fw 10 pmol 1 l
AChE Rv10 pmol 1 l
cDNA khuôn 1,5 l
dd H2O 16 l
Tổng thể tích 25 l
Hỗn hợp đƣợc trộn đều và đặt vào máy PCR. Chu trình nhiệt đƣợc điều chỉnh nhƣ sau:
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
2.2.10. Điện di trên gel agarose
Gel agarose 1%, 2% đƣợc chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 12 mM để tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease. Mẫu DNA đƣợc trộn với đệm mẫu chứa sẵn 50 g/ml ethidium bromide. Điện di đƣợc tiến hành với điện thế ổn định khoảng 10 volt/cm gel và chạy trong vòng 25-30 phút. Sau khi kết thúc điện di bản gel được lấy ra soi dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp ảnh gel Doc (Bio-Rad).
2.2.11. Phương pháp nhân dòng vào vector pGEMT
Sản phẩm của phản ứng PCR nhân bản đoạn gen mã hóa cho enzyme AChE sau khi đã kiểm tra trên gel agarose 1% đƣợc gắn trực tiếp vào vector nhân dòng pGEMT theo kit của Promega. Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm vào vector đầu T trên tổng thể tích 10 l nhƣ sau:
- Sản phẩm PCR: 2 l
- Đệm T4 DNA ligase 10X: 1 l, - T4 DNA ligase: 1 l,
- Vector đầu T: 1 l,
- H2O cất khử trùng, khử ion: 5 l
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 4oC trong 12h và giữ ở nhiệt độ -20oC, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5.
2.2.12. Biến nạp vector chứa đoạn gen chèn vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5
Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vào tế bào E. coli khả biến: tế bào khả biến E. coli chủng DH5 (bảo quản ở -80oC) đƣợc lấy ra để trên đá 10 - 20 phút cho tan dần. Hỗn hợp phản ứng gắn đoạn gen AChE vào vector pGEMT đƣợc bổ sung vào, trộn nhẹ và để trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào, sau đó đƣợc sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây và đƣợc chuyển ngay lên đá 2 phút.
300 - 500 l môi trường LB lỏng được bổ sung vào hỗn hợp biến nạp. Mẫu sau đó đƣợc giữ trong tủ ấm 37oC trong 10 phút và lắc ở tốc độ 150 vòng/phút, 37oC trong
35 chu kỳ
94oC-40 giây 45oC-45 giây 72oC-90 giây
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
50 phút. 50 - 100 l hỗn hợp biến nạp đƣợc cấy trải tế bào trên đĩa petri chứa môi trường LB đặc có 50 g/ml ampicillin, 20 l X-gal 20 mg/ml và 20 l IPTG 100 mM và nuôi trong tủ ấm 37oC trong 12h (Hình 2.1).
Hình 2.1. Nhân dòng đoạn gen mã hóa cho AChE vào vector pGEM T
2.2.13. Phương pháp giải trình tự
Giải trình tự được tiến hành qua 2 bước: bước PCR thông thường để khuếch đại đoạn trình tự cần đọc và bước PCR cho xác định trình tự.
Plasmid tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho PCR thông thường (PCR lần 1) với cặp mồi M13-Fw và M13-Rv (có trình tự nằm trên vector pGEM-T) để khuếch đại đoạn trình tự cần đọc. Sản phẩm PCR lần 1 đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 2% và pha loãng ở nồng độ thích hợp (khoảng 50-100 pmol) đƣợc dùng làm khuôn cho PCR trong xác định trình tự (PCR lần 2).
Thành phần phản ứng PCR cho xác định trình tự gồm:
- Hỗn hợp DTCS (Dye terminator cycle sequencing) Master mix: 4 l - Khuôn: 0,5 l
- Mồi M13 Fw/Rv: 1 l
- H2O khử trùng, khử ion: 20 l
PCR đƣợc thực hiện nhƣ sau: duy trì ở nhiệt độ 96oC trong 1 phút để khởi động nóng ban đầu tiếp theo là 30 chu kỳ gồm 3 bước: duy trì 96oC trong 20 giây để làm biến tính DNA, ở 56oC trong 30 giây để gắn mồi, ở 60oC trong 4 phút để kéo