1.5. Một số nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen acetylcholinesterase
1.5.2. Một số nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen acetylcholinesterase
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Nhằm thu nhận đƣợc một lƣợng lớn enzyme cholinesterase dùng cho mục đích phân tích hoặc trị liệu cũng nhƣ nghiên cứu các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu biểu hiện enzyme này dưới dạng tái tổ hợp.
AChE của người cũng được biểu hiện ở E. coli, sau đó thay thế một vài vùng giàu G-C bởi A-T [30]. Sau khi cảm ứng, protein tái tổ hợp đạt đến nồng độ 10% tổng số protein và đƣợc tích tụ trong thể vùi. Quá trình hòa tan, gập xoắn và oxi hóa đã tạo ra hoạt động của AChE không thể phân biệt đƣợc từ AChE trong hồng cầu tự nhiên trong cơ chất và chất ức chế đặc hiệu nhƣng thiếu các chất ức chế thừa. Những thí nghiệm này đã chứng minh hoạt động của enzyme không đòi hỏi quá trình glycosyl hóa.
AChE của Drosophila và tiểu phần T của AChE Torpedo đã đƣợc biểu hiện thành công ở tế bào côn trùng đã bị nhiễm Baculovirus tái tổ hợp [64]. Trong trường hợp của AChE Drosophila, thu được khoảng 20 mg enzyme hoạt động từ 1 lít dịch nuôi cấy (109 tế bào).
Năm 1995, PCR suy biến đƣợc sử dụng để tách dòng một đoạn gen AChE từ một loài muỗi gây bệnh sốt vàng Aedes aegypti [56]. Đoạn cDNA tách dòng đƣợc chứa khung đọc mở hoàn chỉnh của gen mã hóa cho AChE và có trình tự axit amin suy diễn tương đồng 64% với gen AChE của Drosophila melanogaster và 87% với gen AChE của loài muỗi Anopheles stephensi (Hình 1.8).
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 1.8. So sánh trình tự axit amin suy diễn của AChE từ A. aegypti (Ad), A.stephensi (An) và D.melanogaster (Dr). Vùng axit amin ưa nước (gạch chân), mũi tên chỉ vị trí và hướng của các mồi suy biến dùng để khuếch đại đoạn gen AChE của A.aegypti [56].
Năm 1997, đoạn gen mã hóa AChE dạng T của cá chình điện Nam Mỹ đã đƣợc nhân dòng và biểu hiện. Khi biểu hiện ở các tế bào COS, HEK, và tế bào trứng của chuột, các tiểu đơn vị AChET tạo thành dạng dimer và tetramer.
Năm 1998, gen mã hóa AChE của bò (BoAChE) đã đƣợc nhân dòng từ DNA genome và đã đƣợc xác định cấu trúc gồm có 5 exon mã hóa cho tiểu đơn vị AChE T và tiểu đơn vị thay thế H [40]. Các exon này có sự bảo tồn cao về cấu trúc gen AChE ở động vật có vú. Trình tự axit amin suy diễn của tiểu đơn vị của tiểu đơn vị T ở bò rất giống với ở người, chỉ có 34 vị trí sai khác. Tuy nhiên, trình tự BoAChE nhân dòng khác với trình tự axit amin đã đƣợc công bố của AChE phân lập từ huyết thanh bào thai bò (FBS-AChE). Trình tự gen hoàn chỉnh mã hóa cho tiểu đơn vị BoAChE T đã được biểu hiện trong tế bào 293 phôi thận của người
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
(HEK-293). Các tính chất xúc tác và khả năng phản ứng với các chất ức chế khác nhau của enzym tái tổ hợp BoAChE tương tự như enzym AChE tự nhiên ở bò.
BoAChE tái tổ hợp khi hòa tan tồn tại ở dạng monomer, dimer and tetramer, nhƣng ở FBS-AChE thì dạng tetramer không bền.
Trình tự mã hóa của gen BoAChE được xác định bằng phương pháp PCR, sử dụng DNA genome tách từ tế bào thận của bò đực trưởng thành và dựa trên 2 bản sao độc lập cho mỗi đoạn DNA đƣợc khuếch đại. Các đoạn mồi đƣợc thiết kế để bắt cặp với các exon khác nhau dựa trên sự tương đồng của AChE ở động vật có vú. 6 đoạn DNA khuếch đại (hình 1.9b) đƣợc sử dụng để xác định trình tự gen của AChE của bò: Các đoạn DNA bao gồm phần chứa đầu C của exon 2 (đoạn I), cũng nhƣ đoạn exon 3 (đoạn II) và 6 (đoạn III) đều đƣợc khuếch đại sử dụng mồi thoái hóa có nguồn gốc từ trình tự axit amin của FBS-AChE đã đƣợc công bố, mỗi đoạn này đƣợc nhân dòng tách biệt vào vector pGEM-T (Pomega). Để xác định trình tự của ranh giới giữa exon 2 và 3, hai đoạn bổ sung đã đƣợc khuếch đại và nhân dòng:
phần đầu N của exon 2 (đoạn IV) và intron 2 (đoạn V). Để nhân dòng exon 4 và 5 và thiết lập ranh giới của exon 3 và 6, một đoạn khoảng 2,6 kb (đoạn VI) từ vị trí kết thúc exon 3 kéo dài đến vị trí bắt đầu exon 6 cũng đã đƣợc khuếch đại.
Trình tự mã hóa cho tiểu đơn vị T của BoAChE đã đƣợc tạo thành bởi các exon 2, 3, 4 và 6 thông qua các mối liên kết tổng hợp DNA thích hợp. Trình tự gen mã hóa BoAChE đƣợc nhân dòng vào vector pBo2346 bằng 2 enzyme BspEI ± SalI (hình 1.9c). Sau đó, BoAChE lại tiếp tục đƣợc chuyển vào vector biểu hiện pHuAChE-nc bằng cặp enzyme EcoRV ± SalI và liên kết với một đoạn peptide tín hiệu của AChE ở người (hình 1.9).
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 1.9. Quy trình nhân dòng và biểu hiện AChE của bò [40]
a. Sơ đồ cấu trúc gen AChE của bò suy diễn từ trình tự DNA b. Các đoạn DNA được sử dụng để nhân dòng gen AChE của bò
c. Plasmid pBo2346 mang 4 exon mã hóa cho tiểu đơn vị T của enzyme AChE d. Vector biểu hiện pBoAChE-nc mang gen AChE của bò, gen neo và cat
Khi so sánh trình tự axit amin của tiểu đơn vị T của BoAChE với trình tự axit amin FBS-AChE đã đƣợc công bố đã nhận thấy 13 vị trí sai khác. Tại 2 trong số các vị trí sai khác là Arg-16 và Ser-541 của BoAChE giống với trình tự đã đƣợc xác định của các peptide đƣợc lựa chọn từ AChE ở não bò. Vị trí Arg-16 cũng đƣợc xác định trong AChE ở hồng cầu bò và trị trí Ser-541 nằm trong trình tự DNA mã hóa cho đầu kết thúc C của tiểu đơn vị H. Có 4 vị trí glycosyl hóa giả định đƣợc đƣợc suy diễn từ trình tự axit amin của tiểu đơn vị T của BoAChE tái tổ hợp. Các chuỗi bên có thể đƣợc gắn vào các vị trí axit amin asparagine tại các vị trí 61, 265, 350 và 464 (hình 1.10).
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 1.10. So sánh trình tự axit amin của BoAChE với các trình tự AChE khác [40]
Năm 2010, đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho AChE của loài rầy nâu Nilaparvata lugens đã đƣợc nhân dòng và xác định trình tự [83]. Đoạn cDNA hoàn chỉnh có kích thước 2467 bp bao gồm khung đọc mở 1938 bp, mã hóa cho 646 axit amin. Trình tự axit amin suy diễn từ cDNA gồm có 30 axit amin của một peptit tín hiệu giả định và 616 axit amin của protein trưởng thành với trọng lượng phân tử dự đoán là 69,418 kDal. Trong đó, 3 axit amin Ser242, Glu371, and His485 hình thành các bộ ba xúc tác và 6 cystein tạo nên các cầu liên kết disulfit nội chuỗi đƣợc bảo tồn hoàn toàn, 10 trong số 14 axit amin có vòng thơm ở các vị trí hoạt động cũng đƣợc bảo tồn. Phân tích Northern blot poly(A)+ RNA chỉ ra rằng bản phiên mã có kích
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
thước xấp xỉ 2,6 kb và phân tích Southern blot cho thấy có nhiều khả năng chỉ có một bản copy của gen ở N. lugens. Trình tự protein suy diễn có sự tương đồng nhất với trình tự AChE của loài rầy xanh Nephotettix cincticeps là 83%.
Năm 2013, Jingquan Li và tập thể đã xây dựng một hệ thống biểu hiện cao AChE ở nấm men Saccharomyces cerevisiae, biểu hiện gen AChE có nguồn gốc từ loài ruồi mắt đỏ Drosophila melanogaster (DmAChE) [43]. Điểm đặc biệt là trình tự gen DmAChE đƣợc dung hợp với vùng kết thúc đầu 3‟ của một α-agglutinin cho phép biểu hiện DmAChE trên bề mặt tế bào nấm men, cùng với một đuôi kháng nguyên để phát hiện protein tái tổ hợp (hình 1.11). Trình tự gen đích đƣợc nhân dòng vào vector biểu hiện ở nấm men là vector pYes-DEST52 và trình tự peptide tín hiệu đƣợc thay thế bằng một vùng tiết glucoamylase cho sự biểu hiện cảm ứng.
Sau đó, vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào S. cerevisiae. DmAChE đƣợc biểu hiện và hiển thị trên bề mặt tế bào sau khi cảm ứng bằng galactose. Các kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng protein tái tổ hợp biểu hiện cao, có hoạt độ tương đương với enzyme AChE thương mại và đồng thời cũng có khả năng phát hiện các loại thuốc trừ sâu OP và CB khác nhau thông qua các xét nghiệm ức chế enzyme với độ nhạy cao.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 1.11. Quy trình xây dựng plasmid tái tổ hợp pYES-DEST52-AChE [43]
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang