3.4. Nhân dòng và giải trình tự gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò
3.4.1. Tách chiết RNA tổng số từ máu bò và tổng hợp cDNA
Để nhân bản đoạn gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò, đầu tôi chúng tôi đã tiến hành tách chiết RNA tổng số từ máu bò bằng bộ kit của hãng Bio-Rad.
Kết quả đo quang phổ của mẫu RNA ở bước súng 230 nm là 10,7 ng/àl. RNA tổng số tiếp tục đƣợc sử dụng để tổng hợp cDNA bằng enzyme phiên mã ngƣợc M-MLV Reverse Transcriptase của hãng Enzynomics và mồi hexamer.
cDNA thu đƣợc sẽ đƣợc sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2. Nhân bản gen mã hóa acetylcholinesterase từ hồng cầu bò
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Sau khi đã tách chiết thành công RNA tổng số từ máu bò và tổng hợp đƣợc cDNA, đoạn gen AChE đƣợc nhân bản dựa trên cDNA đã tổng hợp được bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự gen AChE của bò đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen thế giới (NM_001076220.1).
Sau khi PCR và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% , chúng tôi thu được 1 băng DNA có kích thước khoảng 1,8 kb. Trong khi đó, mẫu đối chứng âm (không có khuôn DNA) thì không xuất hiện băng nào (hình 3.8).
Kích thước đoạn gen thu được tương đương với kích thước của đoạn gen AChE (NM_001076220.1) đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen thế giới.
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen AChE từ máu bò Chú thích: 1: Thang chuẩn DNA 1 kb; 2: Mẫu đối chứng (-), không có DNA; 3: Sản phẩm PCR của mẫu cDNA tổng hợp từ RNA tổng số tách từ máu bò
Kết quả này cho phép chúng tôi bước đầu khẳng định đã nhân bản thành công đoạn gen mã hóa cho AChE từ hồng cầu bò.
3.4.3. Nhân dòng gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò vào vector pGEM T
Sau khi nhân bản đoạn gen mã hóa AChE có kích thước khoảng 1,8 kb bằng phương pháp RT-PCR và kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, chúng tôi đã tiến hành gắn trực tiếp đoạn gen này vào vector
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
pGEMT bằng bộ kit của hãng Promega (Đức). Thành phần của phản ứng ligase đƣợc trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng ligase AChE vào vector pGEM T Thành phần phản ứng Phản ứng
chuẩn
Đối chứng dương
Đối chứng âm 2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase 5 àl 5 àl 5 àl
Vector pGEM T (50ng) 1 àl 1 àl 1 àl
Sản phẩm PCR 1 àl - -
DNA chốn đối chứng - 2 àl -
T4 DNA Ligase 1 àl 1 àl 1 àl
H2O 2 àl 1 àl 3 àl
Tổng thể tớch 10 àl 10 àl 10 àl
Hỗn hợp phản ứng ligase đƣợc để 24h ở 4oC, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Kết quả biến nạp thu nhận đƣợc hầu hết các khuẩn lạc trắng và một số khuẩn lạc xanh trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh ampicillin 50 g/ml, với sự cảm ứng của IPTG (1 mM) và cơ chất X-gal (hình 3.9).
Chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc trắng để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen nhân dòng bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi pGEM.Fw và pGEM.Rv được thiết kế đặc hiệu cho vector pGEMT. Theo tính toán lý thuyết, nếu vector có mang đoạn gen AChE thì sản phẩm PCR thu được sẽ có kích thước khoảng 2,1kb, bao gồm kích thước của đoạn gen AChE khoảng 1,8 kb cộng với kích thước đoạn DNA nằm giữa 2 mồi trên vector pGEMT là 0,3 kb.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.9. Sự hình thành các khuẩn lạc sau khi biến nạp hỗn hợp gắn đoạn gen mã hóa AChE và vector pGEMT vào E. coli chủng DH5α
Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR sử dụng DNA từ 3 khuẩn lạc trắng làm khuôn (hình 3.10) cho thấy các sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trắng đều cho băng DNA có kích thước khoảng 2,1 kb (các đường chạy 3-5).
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc kiểm tra vector pGEM-AChE Chú thích 1: Thang chuẩn DNA 1kb; 2: Đối chứng âm; 3- 5: Khuẩn lạc PCR với mồi pGEM Fw/Rv; 6- 8: Khuẩn lạc PCR với mồi AChE Fw/Rv
Khi PCR khuẩn lạc trắng với cặp mồi đặc hiệu AChE Fw/Rv thu đƣợc sản phẩm cho băng DNA kích thước kho ảng 1,8 kb tương đương với kích thước AChE (đường chạy 6-8). Như vậy, đã thu được các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp vector pGEM có chứa đoạn gen nhân bản có kích thước khoảng 1,8 kb đặc hiệu cho
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
AChE. Vì vậy, có thể kết luận đã nhân dòng thành công đoạn gen mã hóa AChE vào vector pGEMT.
Những khuẩn lạc trắng này đƣợc nuôi lắc trong 5-10 ml LB lỏng, bổ sung khỏng sinh ampicillin với nồng độ 50 àg/ml, ở 37oC trong 12h để tỏch plasmid.
Plasmid pGEM-AChE tinh sạch sẽ đƣợc thu nhận bằng 50 àl EB. Sau khi tỏch đƣợc plasmid tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1% (hình 3.11).
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm plasmid pGEM- AChE Chú thích: 1‟: Thang chuẩn ADN 1kb; 2‟: Plasmid pGEM- AChE
Kết quả diện di cho thấy đã tách được plasmid có kích thước khoảng 4,8 kb, tương ứng với kích thước của vector tái tổ hợp pGEM- AChE. Để khẳng định chắc chắn, tiến hành PCR kiểm tra plasmid tách đƣợc bằng cặp 2 mồi đặc hiệu của vector pGEM T và của đoạn gen AChE. Kết quả kiểm tra đƣợc thể hiện ở hình 3.12
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.12. Kết quả PCR kiểm tra plasmid pGEM- AChE
Chú thích:1: Thang chuẩn DNA 1kb; 2: Đối chứng âm; 3: Plasmid pGEM- AChE với mồi pGEM Fw/Rv; 4: Plasmid pGEM- AChE với mồi AChE Fw/Rv
Vector tái tổ hợp đƣợc ký hiệu là pGEM- AChE và đƣợc tách ra ở dạng tinh sạch để cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.4. Giải trình tự của gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò
Để biết chính xác trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa cho AChE, tiến hành giải trình tự đoạn gen này trong vector pGEM-AChE thu đƣợc, tách plasmid từ các khuẩn lạc trắng và tiến hành xác định trình tự các đoạn gen mã hóa AChE. Kết quả phân tích trình tự nucleotide của gen AChE thu đƣợc trong nghiên cứu đƣợc so sánh với trình tự AChE của bò đã đƣợc công bố trên ngân hàng Gen quốc tế (NM_001076220.1) kết quả nhƣ hình 3.13.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.13. So sánh trình tự gen AChE trong nghiên cứu và trình tự AChE của bò đã đƣợc công bố trên thế giới (NM_001076220.1)
Hình 3.14. Phân tích vị trí cắt của các enzyme giới hạn có trên trình tự gen AChE
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Từ hình 3.13 cho thấy, trình tự AChE thu đƣợc trong nghiên cứu có sự tương đồng 100% so với trình tự AChE của bò đã được công bố trên thế giới. Dựa vào kết quả phân tích bằng phần mềm ApE (hình 3.14), trên trình tự gen AChE của hồng cầu bò ở Việt Nam không có vị trí cắt của các enzyme giới hạn là HindIII, BamHI, EcoRI, NdeI, XhoI...Trình tự gen mã hóa cho enzyme AChE có nguồn gốc từ loài ruồi mắt đỏ D.melanogaster đã đƣợc nhân dòng và biểu hiện thành trong vector pYes-DEST52. Trong đó, nhóm nghiên cứu đã sử dụng các enzyme giới hạn NdeI, XhoI, SmBI, BglII và NotI đều là những enzyme không có vị trí cắt trên trình tự gen AChE của hồng cầu bò. Vì vậy, việc lựa chọn thiết kế cặp mồi PCR để thêm trình tự nhận biết của hai enzyme NdeI vào đầu 5' và EcoRI đầu 3' của gen mã hóa AChE là hoàn toàn phù hợp để sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp.
Trình tự các acid amin của protein AChE cũng đã đƣợc nghiên cứu và công bố trên cơ sở dữ liệu về trình tự của protein UniProt. Qua đó, cho thấy rằng AChE của bò là một chuỗi gồm 610 acid amin, có 3 vị trí hoạt động (hình 3.15), 4 vị trí glycosyl hóa và 4 vị trí cầu nối disunfua (hình 3.16). Chuỗi peptide tín hiệu gồm các acid amin từ vị trí 1-30.
Hình 3.15. Các vị trí glycosyl hóa và vị trí hình thành cầu nối disunfua của AChE của bò (Nguồn: UniProt)
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.16. Trình tự acid amin enzyme AChE của bò với các vị trí trung tâm hoạt động đƣợc khoanh tròn (Nguồn: UniProt)
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.17. Trình tự acid amin enzyme AChE của người với các vị trí trung tâm hoạt động đƣợc khoanh tròn (Nguồn: UniProt)
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.18. So sánh trình tự gen AChE của bò trong nghiên cứu và trình tự AChE của người đã được công bố trên thế giới (M55040.1)
Trình tự các axit amin của protein AChE ở người cũng đã được nghiên cứu và công bố trên cơ sở dữ liệu về trình tự của protein UniProt. So sánh trình tự acid amin AChE của người và bò cho thấy, AChE của người có các axit amin ở trung tâm hoạt động (active site) và các subsite – quyết định tính đặc hiệu và hoạt động của enzyme - trùng với AChE của bò (Hình 3.17). Trình tự gen AchE bò thu đƣợc trong nghiên cứu có sự tương đồng 91% so với trình tự gen AChE của người đã được công bố trên thế giới (hình 3.18). Bên cạnh đó, AChE của người đã được nhân dòng và biểu hiện thành công trong E.coli [28]. Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất AChE của bò bằng con đường tái tổ hợp, biến nạp vào E.coli là hoàn toàn khả thi.