1.4. Các phương pháp chuyển gen vào nấm sợi
1.4.3. Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Trong tự nhiên, vùng cổ rễ của những loài thực vật hai lá mầm thường xuất hiện những khối u gồm các tế bào không phân hóa và phát triển không có tổ chức.
16
Những tế bào này phân chia một cách liên tục không thể kiểm soát nhƣ tế bào ung thƣ ác tính ở động vật. Hiện nay, loại khối u này đã đƣợc biết đến là mụn cây do loài vi khuẩn A. tumefaciens gây nên. A. tumefaciens là vi khuẩn Gram âm, có khả năng chèn các gen của mình vào tế bào vật chủ và sau đó sử dụng bộ máy của vật chủ để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. Vi khuẩn A. tumefaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, tạo nên những mụn sần trên cây [70, 80]. Cơ chế hình thành khối u cảm ứng này đã đƣợc nghiên cứu từ nhiều năm nay và đã mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong ứng dụng vi khuẩn A. tumefaciens vào chuyển gen ở thực vật và nấm [31, 37].
Đến nay bản chất phân tử của quá trình cảm ứng phát sinh khối u do vi khuẩn A. tumefaciens gây ra đã được làm sáng tỏ. Các tế bào bị thương tiết ra những hợp chất polyphenolic thu hút các tế bào vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên, vi khuẩn A. tumefaciens không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển một đoạn DNA nhỏ (T-DNA: tranferred DNA) vào bên trong tế bào. Đoạn DNA này nằm trên một plasmid đặc biệt gọi là Ti plasmid (tumor inducing plasmid) [70]. T- DNA sau khi chèn vào hệ gen của tế bào vật chủ sẽ gây ra khối u ở thực vật. Sự phát triển của khối u sau đó sẽ không còn phụ thuộc vào sự có mặt của vi khuẩn Agrobacterium [37, 81].
1.4.3.2. Ti plasmid
Trong những năm 1970, các nhà khoa học đã tìm thấy trong những chủng vi khuẩn A. tumefaciens tạo khối u có một plasmid rất lớn kích thước từ 200 - 800 kb [22, 81]. Từ những thí nghiệm trên những chủng A. tumefaciens không có plasmid này, người ta kết luận plasmid nói trên cần thiết cho tạo khối u. Vì vậy, chúng được gọi là Ti plasmid (Tumor inducing plasmid). Cấu trúc của một Ti plasmid đƣợc thể hiện trên Hình 1.4.
17
Hình 1.4. Cấu trúc của Ti plasmid [81]
Trên Ti plasmid chứa 2 yếu tố cần thiết cho quá trình chuyển gen: vùng gen vir - virulence genes (vùng độc lực) và T-DNA. Vùng gen vir chứa khoảng 25 gen mã hóa cho các protein (virA, virG, virE và một số protein khác) có vai trò cắt, chuyển và chèn vùng T-DNA vào hệ gen của tế bào chủ. Sự hoạt động của vùng gen vir này đƣợc cảm ứng bởi một hợp chất phenolic có nguồn gốc từ thực vật có tên là acetosyringone (AS) [70]. Một vài Ti plasmid chỉ có một T-DNA, một số khác lại có thể có nhiều vùng T-DNA. T-DNA là một đoạn DNA có kích thước khoảng 10 - 30 kb, chiếm tỷ lệ nhỏ hơn 10% kích thước của Ti plasmid, được chuyển vào trong hệ gen của tế bào chủ. T - DNA đƣợc giới hạn bởi 2 vùng: biên trái (LB) và biên phải (RB) chứa trình tự lặp lại 25 bp có độ tương đồng cao và là vị trí nhận biết cho việc cắt T-DNA. T-DNA mang các gen liên quan đến việc tạo khối u [69]. Những gen này sau khi đƣợc gắn vào hệ gen của tế bào chủ sẽ tham gia vào quá trình tổng hợp auxin và cytokinin. Đây là các hợp chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục dẫn đến hình thành khối u. Nhờ đặc điểm này, người ta có thể loại bỏ các gen tạo khối u nằm trong hai đầu biên của T-DNA và thay vào đó bằng các gen mong muốn. Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào chủ hoặc mô thực vật chuyển gen có thể phát triển bình thường. Nếu không có trình tự tương đồng giữa
18
hệ gen của tế bào chủ và T-DNA đƣợc chuyển, T-DNA sẽ đƣợc chèn một cách ngẫu nhiên vào hệ gen của tế bào chủ. Nếu những đoạn gen có độ tương đồng cao với hệ gen của tế bào chủ, sự tái tổ hợp tương đồng sẽ xảy ra. Tần suất tái tổ hợp tương đồng khác nhau khi chuyển những đoạn gen có kích thước khác nhau [31]. Ngoài các gen tạo khối u, trên T-DNA còn chứa một nhóm gen opine. Những gen này mã hóa cho các enzyme giúp cho tế bào thực vật tổng hợp một số axit amin đặc biệt mà vi khuẩn A. tumefaciens có khả năng phân giải, đƣợc gọi là opine. Đây là một nhóm các hợp chất hóa học đƣợc sử dụng nhƣ nguồn cũng cấp nitơ chính cho A.
tumefaciens [107].
1.4.3.3.Cơ chế lây nhiễm của vi khuẩn A. tumefaciens
Vi khuẩn A. tumefaciens chủ yếu lây nhiễm thực vật qua các vết thương.
Thực vật bị thương tiết ra các hợp chất trong đó có đường và các axit vô cơ sẽ thu hút vi khuẩn xâm nhiễm theo cơ chế hóa hướng động. Khi tiếp cận được vết thương, chúng tấn công vào bề mặt và tổng hợp nên các sợi cellulose, đồng thời thực vất tiết ra hợp chất phenolic (acetosyringone) hoạt hóa vùng gen vir của vi khuẩn. Hệ thống điều hòa gen vir hoạt động thông qua 2 gen độc virA, virG. VirA tổng hợp nên protein VirA nằm trong màng tế bào, đáp ứng với sự trao đổi chất ở vết thương và nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường. Với nồng độ AS thích hợp, sự có mặt của đường sẽ kích thích gen virA dẫn đến sự tự phosphoryl hóa của VirA. Sự tự phosphoryl hóa này dẫn đến hệ quả protein nội bào VirG đƣợc phosphoryl hóa bởi axit aspartic còn lại từ sự phosphoryl hóa của VirA và kích hoạt tất cả sự sao mã của các gen vir. Sau khi đƣợc kích hoạt, các gen vir sẽ điều khiển sự tạo thành sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn. Quá trình này đƣợc thực hiện bởi protein VirD1 và VirD2. Sau đó, VirD2 sẽ gắn vào T-DNA tạo thành phức hợp sợi đơn T-DNA. Phức hợp T-DNA-VirD2 và VirE sẽ đƣợc chuyển vào tế bào thực vật nhờ hệ thống chuyển nạp đƣợc mã hóa bởi các gen virB. Operon virB gồm 11 gen mã hóa cho việc hình thành cầu nối pili, là con đường vận chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào trong tế bào thực vật. Các protein của vi khuẩn sẽ đƣa T-DNA vào trong nhân tế bào nhờ
19
sự hỗ trợ của một số thành phần trong tế bào thực vật. Ở trong nhân, T-DNA sẽ chèn một cách ngẫu nhiên vào hệ gen của vật chủ [70, 80, 22].
1.4.3.4. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Khi có mặt chất cảm ứng, vi khuẩn A. tumefaciens sẽ chuyển T-DNA của nó vào tế bào thực vật. Lợi dụng cơ chế này, A. tumefaciens đƣợc dùng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào thực vật từ những năm 1980. Năm 1998, vi khuẩn này lần đầu tiên được ứng dụng thành công để chuyển gen vào nấm sợi. Phương pháp này được đánh giá là phương pháp đơn giản để chuyển gen vào nấm sợi và đã được thực hiện thành công trên nhiều loại nấm sợi khác nhau [22, 69, 70, 96].
Chuyển gen thông qua A. tumefaciens cần một hệ thống vector nhị thể. Hệ vector nhị thể đặc trƣng bởi hai plasmid tái bản độc lập gồm vector nhị thể (binary vector) chứa T-DNA mang gen cần chuyển và Ti plasmid cải biến chỉ mang vùng gen vir hỗ trợ cho việc chuyển T – DNA (còn gọi là helper plasmid). Vector nhị thể đƣợc thiết kế bao gồm các thành phần: điểm khởi đầu sao chép hoạt động ở cả E.
coli và A. tumefaciens, MCS (multiple cloning site - vị trí cắt nối đa điểm), các marker chọn lọc hoạt động đƣợc ở vi khuẩn và vật chủ, biên trái và biên phải của T- DNA. Ti plasmid hỗ trợ (helper plasmid) được cải biến từ Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ các gen tạo khối u và giữ lại vùng gen vir để duy trì chuyển DNA vào tế bào chủ [40]. Hệ thống vector nhị thể đƣợc Michielse và các cộng sự mô tả trong Hình 1.5.
20
Hình 1.5. Mô hình vi khuẩn A. tumefaciens với hệ thống vector nhị thể [69]
Một hệ thống vector khác cũng từng được sử dụng trong phương pháp ATMT là vector đồng tích hợp (co - integrated vector). Vector đồng tích hợp hoạt động dựa trên cơ chế tái tổ hợp tương đồng giữa plasmid nhỏ có nguồn gốc từ vi khuẩn và Ti plasmid. Ti plasmid cũng đƣợc loại bỏ vùng gen tạo khối u và giữ nguyên vùng gen vir hỗ trợ quá trình chuyển gen vào tế bào chủ. Plasmid nhỏ của vi khuẩn đƣợc thiết kế gắn gen cần chuyển vào giữa vùng biên trái (LB) và biên phải (RB). Khi cả hai vector có mặt trong cùng một vi khuẩn A. tumefaciens, quá trình tái tổ hợp diễn ra khiến cho gen cần chuyển đƣợc tích hợp vào vùng T-DNA của plasmid [72]. Ngày nay, hệ thống vector đồng tích hợp trở nên ít phổ biến hơn so với hệ thống vector nhị thể do khó khăn trong quá trình thiết kế [57]. Hơn nữa, sử dụng vector nhị thể có nhiều thuận lợi hơn vector đồng tích hợp do không cần quá trình tái tổ hợp in vivo. Tốc độ chuyển gen khi sử dụng vector nhị thể nhanh hơn, chỉ mất 2 - 3 ngày trong khi chuyển gen sử dụng vector đồng tích hợp phải mất 4 - 7 ngày. Hơn nữa, hiệu quả chuyển gen khi sử dụng hệ thống vector nhị thể đƣợc chứng minh hiệu quả hơn rất nhiều so với khi sử dụng vector đồng tích hợp [72].
1.4.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
21
Chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (ATMT) là phương pháp đơn giản được sử dụng phổ biến hiện nay nhờ những ưu điểm vượt trội. Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen vào nấm phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau.
Yếu tố đầu tiên ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen nhờ A. tumefaciens là nguyên liệu dùng chuyển gen. Nguyên liệu ban đầu dùng cho chuyển gen thành công vào nấm rất đa dạng, có thể là bào tử, tế bào trần, hệ sợi, … [37, 69]. So với hai phương pháp chuyển gen bằng tế bào trần và chuyển gen bằng xung điện yêu cầu nguyên liệu đầu vào bắt buộc là tế bào trần thì đây là một ƣu điểm nổi bật do quá trình tạo tế bào trần khá phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật cao và chi phí đắt đỏ. Thời gian bảo quản bào tử nấm cũng có thể ảnh hưởng tới hiệu quả của chuyển gen.
Nguyên liệu đƣợc bảo quản trong thời gian dài sẽ làm giảm hiệu quả chuyển gen trong quá trình đồng nuôi cấy với vi khuẩn, hoặc giảm tỷ lệ nảy mầm của các bào tử chuyển gen so với bào tử mới [69].
Sự thành công của phương pháp ATMT cũng được quyết định bởi chủng vi khuẩn A. tumefaciens. Các chủng vi khuẩn A. tumefaciens đã đƣợc sử dụng thành công để chuyển gen vào nấm sợi cũng rất đa dạng nhƣ AGL1, LBA4404, EHA105, LBA1100, ... Hiệu suất chuyển gen khi dùng các chủng vi khuẩn A. tumefaciens là khác nhau với các vật chủ khác nhau nên. Chủng LBA1100 và plasmid pTiB6 đƣợc kết luận là cho hiệu quả chuyển gen cao vào A. awamori và A. niger. Những chủng vi khuẩn A. tumefaciens khác cũng đƣợc sử dụng ở A. awamori nhƣ A348, LBA1119, LBA1126 … nhƣng phải sử dụng Ti plasmid hỗ trợ khác mới cho hiệu quả. Phương pháp ATMT sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 ở nấm A.
oryzae cũng đƣợc chứng minh là rất hiệu quả. Với mỗi chủng vi khuẩn A.
tumefaciens cần phải điểu chỉnh các yếu tố của việc đồng nuôi cấy để thu đƣợc kết quả tốt nhất [69, 77, 78].
Nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS) cũng là một yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Trong hầu hết
22
các nghiên cứu trước đây, AS được bổ sung trong môi trường cảm ứng ở giai đoạn đồng nuôi cấy nhằm cảm ứng hoạt động của gen vir [31, 69, 80]. Ở một số trường hợp, AS còn đƣợc bổ sung trong giai đoạn nuôi lắc cảm ứng với A. tumefaciens nhƣng không bắt buộc, thậm chí còn có thể làm giảm hiệu suất biến nạp với các vật chủ nhƣ Fusarium oxysporum, Magnaporthe grisea [69, 70].
Một yếu tố quyết định tới hiệu quả chuyển gen bằng phương pháp ATMT là tỷ lệ đồng nuôi cấy giữa nguyên liệu nấm và vi khuẩn A. tumefaciens. Tăng tế bào vi khuẩn A. tumefaciens và nấm có thể làm tăng hiệu quả chuyển gen. Tuy nhiên, cả hai yếu tố trên có một giới hạn nhất định. Nếu tăng lƣợng tế bào vi khuẩn A.
tumefaciens vƣợt quá nồng độ thích hợp sẽ dẫn đến hiện tƣợng cạnh tranh dinh dưỡng, và gây khó khăn trong việc tiêu diệt vi khuẩn khi chuyển sang môi trường chọn lọc thể nấm chuyển gen. Ngƣợc lại, quá nhiều bào tử nấm sẽ dẫn đến tình trạng mọc nền hoặc việc phân lập thể chuyển gen sẽ rất khó khăn [69, 70].
Điều kiện đồng nuôi cấy vi khuẩn và nguyên liệu nấm cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của phương pháp ATMT. Điều kiện đồng nuôi cấy nấm và vi khuẩn gồm thời gian, nhiệt độ và loại màng lọc. Nhiệt độ đồng nuôi cấy dao động từ 20°C - 28°C, nhưng nhiệt độ tối ưu thường là từ 22°C - 25°C, trong thời gian từ 2 - 3 ngày [22, 80]. Ở nấm A. awamori, nhiệt độ thích hợp cho chuyển gen là 20oC - 28 oC và thời gian đồng nuôi cấy kéo dài từ 16 - 96 giờ. Tuy nhiên, điều kiện tối ƣu là 22.5oC - 25oC trong thời gian 2 - 3 ngày [69]. Ngoài ra, các loại màng lọc khác nhau nhƣ cellulose, nitrocellulose, nylon cũng sẽ cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [69].
Ngoài những yếu tố cơ bản trên, còn có một số yếu tố khác cũng ảnh hưởng tới hiệu quả của việc chuyển gen nhƣ loài nấm, nồng độ kháng sinh, quy trình chuyển gen... Vì vậy, muốn hiệu quả chuyển gen cao nhất cần tối ƣu các điều kiện để tìm ra quy trình phù hợp nhất với từng loài.
1.4.3.6. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp ATMT
23
Chuyển gen vào nấm sợi bằng phương pháp ATMT được đánh giá là tốt hơn so với các phương pháp chuyển gen truyền thống như chuyển gen bằng xung điện, chuyển gen bằng tế bào trần. Thứ nhất, nguyên liệu đƣợc dùng để đồng nuôi cấy với A. tumefaciens vô cùng đa dạng. Chúng có thể là bào tử, tế bào trần, sợi nấm, bào tử nảy mầm, hoặc thậm chí là từ cặn tế bào [69, 70]. Trong khi đó, phương pháp chuyển gen bằng tế bào trần đòi hỏi nguyên liệu nấm phải là các tế bào trần hình thành từ khuẩn ty sau khi xử lý với phức hệ enzyme. Mặc dù hiệu suất chuyển gen vào nấm bằng tế bào trần cũng rất cao nhƣng trên thực tế tiến hành gặp nhiều cản trở. Nguồn nguyên liệu tế bào trần đƣợc tạo ra sau khi sử dụng hỗn hợp enzyme loại bỏ thành tế bào nấm phải đƣợc sử dụng ngay, nên các thí nghiệm cần hoàn thiện trong ngày. Việc sử dụng các loại enzyme đắt tiền để loại bỏ thành tế bào nấm cũng là một khó khăn với hầu hết các phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Chất lƣợng của tế bào trần phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ tuổi của hệ sợi nấm, loại enzyme dùng để loại bỏ thành tế bào, thời gian ủ giữa sợi nấm và enzyme, … Quy trình chuyển gen qua protoplast với nhiều bước phức tạp đòi hỏi người thực hiện phải có kỹ năng cao. Chính vì vậy, hiệu suất chuyển gen thường không ổn định giữa những lần thực hiện khác nhau [59, 65].
Thứ hai, hiệu suất chuyển gen bằng phương pháp ATMT thường cao và ổn định hơn so với các phương pháp truyền thống. Theo thống kê, hiệu quả chuyển gen bằng ATMT thường đạt được 300 - 900 thể chuyển gen với 107 bào tử, cao hơn 600 lần so với phương pháp chuyển gen bằng tế bào trần nhờ polyethylene glycol (PEG) [90]. Chuyển gen vào A. awamori nhờ A. tumefaciens có hiệu suất cao hơn phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng PEG khoảng 400 lần [69]. Với vật chủ là Colletotrichum gloeosporioides, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacteium cao gấp 5 - 10 lần so với chuyển gen nhờ tế bào trần. Với một số vật chủ khác, chẳng hạn nhƣ Neurospora crassa, Trichoderma reesei, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium tương tự với hiệu suất chuyển gen nhờ tế bào trần đã được tối ưu [12, 21, 70].
Ưu điểm thứ ba là kích thước của đoạn DNA được chuyển vào tế bào chủ.
Với phương pháp chuyển gen bằng tế bào trần, kích thước của đoạn DNA ngoại lai
24
được đưa vào chỉ ở khoảng 40 kb. Chuyển gen bằng phương pháp ATMT cho phép chúng ta đưa đoạn DNA ngoại lai có kích thước lên đến 150 kb vào trong hệ gen của tế bào nấm [13].
Một ưu điểm khác của phương pháp này là có thể tạo ra một bộ sưu tập những thể đột biến ngẫu nhiên do đoạn T-DNA có khả năng chèn vào các vị trí khác nhau trong hệ gen của tế bào chủ. Vi khuẩn A. tumefaciens có xu hướng chỉ chèn một bản T-DNA vào hệ gen nấm dẫn đến phá hủy một gen nào đó ở thể chuyển gen tương ứng. Đặc tính này được ứng dụng để xác định chức năng của một số gen sinh tổng hợp các chất liên quan đến quá trình phát triển và gây bệnh của một số loài nấm khác nhau. Việc xóa gen nhờ cơ chế trao đổi DNA tương đồng ở nấm sử dụng phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens cũng đạt được hiệu suất rất cao. Khi sử dụng PEG thông qua protoplast, hiệu quả xóa gen chỉ vào khoảng 1% - 50%, tuy nhiên có thể đạt đến 97% khi sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens [21].
Bên cạnh những ưu điểm, phương pháp này cũng có một số nhược điểm nhất định. Thời gian thí nghiệm dài hơn so với các phương pháp khác do cần thời gian cho bước đồng nuôi cấy giữa nấm và vi khuẩn. Ngoài ra, phương pháp này cũng không ƣu thế để tạo nên những chủng sinh vật mang một số lƣợng lớn bản sao T- DNA để tăng quá trình biểu hiện của gen, do vi khuẩn Agrobacterium có xu hướng tích hợp chỉ một bản sao vào hệ gen nấm [69]. Tuy nhiên, với những ƣu điểm nổi bật trên, có thể khẳng định chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens là phương pháp đơn giản, ổn định và cho hiệu quả cao. Thậm chí, với một số loài nấm, việc chuyển gen chỉ khả thi khi sử dụng phương pháp này.
1.4.3.7. Ứng dụng phương pháp ATMT trong cải biến di truyền ở nấm sợi
Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đã được chứng minh là hiệu quả hơn các phương pháp chuyển gen thông thường khác, thậm chí ở một số loài chỉ chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens mới khả thi. Phương pháp ATMT có thể giúp tạo một bộ sưu tập lớn các thể đột biến ngẫu nhiên do DNA chèn vào hệ gen của tế bào vật chủ [68, 74]. Phương pháp này còn có khả năng tăng