3.2. Tạo thành công chủng N402 đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil
3.2.2. Xóa thành công gen pyrG ở A. niger N402
Để xóa gen pyrG ở A. niger N402, đầu tiên vector xóa pKO2-ΔpyrG đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng phương phỏp xung điện. Thờm 500 àl LB lỏng vào ống biến nạp và nuôi lắc ở 28oC, tốc độ 200 vòng/phút trong một giờ.
53
Dịch nuôi đƣợc ly tâm thu cặn và cấy trải trên đĩa LB có bổ sung kanamycin để chọn lọc các khuẩn lạc vi khuẩn nhận đƣợc cấu trúc xóa gen. Ba khuẩn lạc đƣợc chọn ngẫu nhiên để kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2 ). Kết quả cho thấy 2 khuẩn lạc cho sản phẩm PCR có kích thước khoảng 2,2 kb, nhỏ hơn 564 bp so với kích thước của đoạn pyrG nguyên gốc là 2,8 kb (Hình 3.4).
Nhƣ vậy, 2 trong 3 khuẩn lạc A. tumefaciens AGL1 đã nhận đƣợc cấu trúc xóa gen.
Hình 3.4. Kết quả PCR kiểm tra 3 khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector xóa pyrG A1, A2, A3. M: 1kb DNA marker, (+) Đối chứng dương sử dụng khuôn là đoạn pyrG
nguyên gốc 2,8 kb
Vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc xóa gen pyrG đƣợc sử dụng để chuyển vào nấm sợi A. niger. Quy trình xóa gen đƣợc thực hiện dựa trên quy trình xóa gen pyrG ở Aspergillus oryzae [77]. Một số thông số đã đƣợc thay đổi cho phù hợp với A. niger. Bào tử nấm và vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc ủ chung trên môi trường cảm ứng ở nhiệt độ tối ưu 22oC. Quá trình đồng nuôi cấy kéo dài 2,5 ngày.
Sau đó màng chuyển gen sẽ được chuyển sang đĩa môi trường chọn lọc CD có bổ sung 5-FOA, 0,1% uridine và 0,1% uracil để sàng lọc các thể xóa gen. Các bước của quy trình xóa gen ở A. niger đƣợc tóm tắt trong Hình 3.5.
54
Hình 3. 5. Quy trình xóa gen pyrG ở nấm sợi A. niger sử dụng phương pháp ATMT Sau 5 ngày, trên môi trường chọn lọc CD pH 5,5 + 0,1% uridine + 0,1%
uracil + 0,2% 5-FOA, một số khuẩn lạc kháng 5-FOA xuất hiện trong khi đĩa đối chứng sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens không mang vector xóa không xuất hiện khuẩn lạc nào. Kết quả của quá trình xóa gen đƣợc thể hiện trong Hình 3.6.
Hình 3.6. Kết quả xóa gen trên môi trường chọn lọc CD bổ sung 0,1% uridine, 0,1% uracil và 0,2% 5 – FOA. Đối chứng sử dụng chủng AGL1 không mang vector
xóa pyrG
55
Các thể nấm kháng 5-FOA được cấy chuyển đồng thời sang ba môi trường CD; CD + 0,1% uridine + 0,1% uracil và CD + 0,1% uridine + 0,1% uracil + 0,2%
5-FOA sử dụng chủng tự nhiên A. niger N402 (WT) làm đối chứng. Kết quả cho thấy trên môi trường tối thiểu CD, chủng đột biến không sinh trưởng được trong khi chủng tự nhiên phát triển bình thường. Ngược lại, trên môi trường CD + uridine + uracil + 5-FOA, chủng đột biến có khả năng sinh trưởng bình thường trong khi chủng tự nhiên không sinh trưởng được do sự chuyển hóa của 5-FOA gây độc tế bào. Cả chủng tự nhiên và chủng đột biến đều sinh trưởng tốt trên môi trường CD + uridine + uracil (Hình 3.7).
Hình 3.7. Kiểm tra khả năng sinh trưởng của chủng đột biến trên các môi trường khác nhau, đối chứng sử dụng chủng A. niger N402
Để khẳng định chính xác các chủng kháng 5-FOA thu đƣợc có phải là các chủng đột biến xóa gen pyrG hay không, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số từ 4 chủng nêu trên và kiểm tra cấu trúc gen pyrG bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2). Theo tính toán lý thuyết, kích thước sản phẩm PCR thu được đối với chủng tự nhiên là 2,78 kb; trong khi đó kích thước sản phẩm PCR từ các chủng xóa gen pyrG sẽ nhỏ hơn 564 bp và vào khoảng 2,2 kb. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chủng X4 là chủng đột biến xóa gen pyrG. Các chủng X1, X2, X3 mặc dù kháng 5-FOA và khuyết dƣỡng uridine/uracil nhƣng gen pyrG vẫn còn nguyên vẹn giống với chủng tự nhiên (Hình 3.8B). Có thể chủng X1, X2, X3 do trong quá trình chuyển gen, T-DNA đã chèn ngẫu nhiên và làm hỏng một gen nào đó liên quan đến quá trình sinh tổng hợp uridine/uracil.
56
Hình 3.8. Xác nhận các chủng xóa gen pyrG. (A) Sơ đồ trao đổi chéo và vị trí các cặp mồi dùng để xác nhận chủng xóa gen, (B) PCR xác nhận 4 chủng đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil X1, X2, X3, X4 sử dụng cặp mồi AnpyrG-P1/P2, (C) PCR xác nhận chủng X4 sử dụng cặp mồi AnpyrG-ORF-F/R, (D) PCR xác nhận chủng X4 sử dụng cặp mồi AnpyrG-ORF-F/AnpyrG-P3. Đối chứng âm sử dụng nước cất
vô trùng. WT: sử dụng DNA của chủng N402. M: 1 kb DNA marker
57
Để khẳng định chắc chắn, chủng X4 là chủng xóa gen pyrG, chúng tôi tiếp tục kiểm tra chủng đột biến xóa gen X4 với cặp mồi An-pyrG-ORF-F/R và cặp mồi kết hợp An-pyrG-ORF-F và mồi An-pyrG-P3 (Bảng 2.2). Cặp mồi An-pyrG-ORF khuếch đại khung đọc mở (ORF) gen pyrG, với chủng tự nhiên sẽ cho băng 1,05 kb, trong khi đó chủng đột biến lên băng 0,49 kb (Hình 3.8C). Nhƣ vậy, khung đọc mở của gen pyrG ở chủng đột biến X4 đã bị loại bỏ một đoạn kích thước 564 bp giống nhƣ tính toán lý thuyết. Cặp mồi An-pyrG-ORF-F/An-pyrG-P3 đƣợc sử dụng thêm để khẳng định rằng đoạn gen bị xóa nằm trên locus của gen pyrG, trong đó mồi An- pyrG-P3 gắn vào vùng nằm ngoài cấu trúc xóa. Kết quả thu đƣợc, chủng đột biến lên băng 1,52 kb, nhỏ hơn 564 bp so với chủng tự nhiên 2,08 kb (Hình 3.8D). Với tất cả những kết quả trên, chúng tôi kết luận rằng chủng đột biến X4 đã bị xóa gen pyrG theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng.
Trước đây, việc tạo chủng A. niger đột biến xóa gen pyrG đã được thực hiện thành công bằng phương pháp sử dụng tia UV gây đột biến ngẫu nhiên và xóa gen theo cơ chế trao đổi chéo tương đồng sử dụng biện pháp chuyển gen bằng tế bào trần [38, 79]. Tuy nhiên, sử dụng tia UV gây ra nhiều loại đột biến nhƣ dịch khung, thay thế nucleotide, xóa nucleotide, tái tổ hợp và sắp xếp lại vật chất di truyền. Mặt khác, tia UV thường tạo ra nhiều đột biến ở những vị trí khác nhau nên rất khó để kiểm soát cấu trúc di truyền của thể đột biến xóa gen [58]. Xóa gen bằng tế bào trần cũng cho hiệu suất cao nhƣng rất tốn kém do hóa chất và enzyme đắt tiền, hơn nữa quy trình thực hiện gồm nhiều bước phức tạp [99]. Việc xóa gen pyrG sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đơn giản hơn so với hai phương pháp trên, dễ dàng tạo được đột biến đích theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng. Hơn nữa, đây là lần đầu tiên việc xóa gen pyrG đƣợc thực hiện thành công trên chủng nấm mốc A. niger N402 bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
58
3.3. Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil DsRed là gen chỉ thị huỳnh quang đƣợc sử dụng phổ biến trong chuyển gen ở nấm, thực vật và đã đƣợc biểu hiện thành công ở nhiều loài nấm sợi nhƣ A. oryzae, A. nidulans, A. fumigatus… Chính vì vậy, DsRed đƣợc chọn làm gen chỉ thị cho tối ưu quy trình chuyển gen vào A. niger trợ dưỡng sử dụng phương pháp ATMT và vector nhị thể tạo mới là pEX2A.
3.3.1. Tạo vector nhị thể pEX2A
Vector pEX2A đƣợc tạo dựa trên cấu trúc của vector pEX2, chứa gen mã hóa huỳnh quang đỏ DsRed đƣợc điều khiển bởi promoter gpdA từ A. nidulans và marker trợ dƣỡng pyrG của A. niger. Đoạn gen pyrG của A. niger đƣợc khuếch đại với cặp mồi An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2), sau đó đƣợc xử lý với hai enzyme XbaI và EcoRI. Sau khi tinh sạch, đoạn cắt sẽ đƣợc gắn vào khung vector pEX2 đã đƣợc xử lý trước đó bởi 2 enzyme giới hạn EcoRI và SpeI (Hình 3.9). Vector pEX2A sau khi tạo thành đƣợc cắt kiểm tra bằng enzyme XhoI (có 2 trình tự nhận biết nằm bên trong gen pyrG của A. niger và 1 trình tự nhận biết nằm trên khung vector pEX2).
Điện di sản phẩm của phản ứng cắt trên gel agarose 0,7% trong 30 phút, 90 V, kết quả thu được ba băng có kích thước là 1,24 kb; 2,35 kb và 8,29 kb (Hình 3.9). Kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết, nên có thể khẳng định cấu trúc vector pEX2A đã đƣợc tạo thành công.
59
Hình 3.9. Sơ đồ tạo cấu trúc vector pEX2A. (A) Quá trình nối đoạn pyrG của vào khung vector pEX2 để tạo vector pEX2A, (B) Sơ đồ cắt kiểm tra vector pEX2A với
enzyme XhoI và ảnh điện di kết quả cắt kiểm tra
3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ uridine/uracil đến sự phục hồi sinh trưởng của chủng xóa gen pyrG
Chủng N402 xóa gen pyrG không có khả năng tự tổng hợp uridine/uracil nên không thể sinh trưởng trên môi trường tối thiểu không có mặt uridine/uracil. Vì đặc điểm này nên trong giai đoạn đồng nuôi cấy bào tử nấm và vi khuẩn A. tumefaciens, môi trường cảm ứng IM phải được bổ sung uridine/uracil. Để xác định nồng độ uridine/uracil thích hợp cần phải bổ sung, chúng tôi tiến hành kiểm tra mức độ phục hồi của chủng xóa gen pyrG trên môi trường nuôi cấy có bổ sung các nồng độ uridine/uracil khác nhau. Các chủng xóa gen sẽ được cấy trên 9 môi trường tối thiểu CD bổ sung lần lƣợt: 0,01% uridine; 0,02% uridine; 0,03% uridine; 0,01% uracil;
0,02% uracil; 0,03% uracil; 0,01% uridine + 0,01% uracil; 0,02% uridine + 0,02%
60
uracil; 0,03% uridine + 0,03% uracil. Sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C, mức độ phục hồi của chủng xóa gen pyrG đƣợc thể hiện trong Hình 3.10.
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ uridine/uracil đến khả năng sinh trưởng của chủng đột biến xóa gen pyrG. (A) Hình thái của chủng xóa gên trên CD môi trường
bổ sung 3 nồng độ uridine: 0,01%; 0,02%, 0,03%, (B) Hình thái của chủng xóa gen trên môi trường CD bổ sung ba nồng độ uracil: 0,01%; 0,02%; 0,03%, (C) Hình thái
của chủng xóa gen trên môi trường CD bổ sung cả uridine và uracil với nồng độ mỗi loại: 0,01%; 0,02%; 0,03%
Trên môi trường CD bổ sung 0,01% uracil; 0,02% uracil và 0,03% uracil cả chủng tự nhiên và chủng xóa gen đều sinh trưởng được và hình thành bào tử màu đen, nhƣng chủng xóa gen phát triển chậm hơn rất nhiều so với chủng tự nhiên (Hình 3.10B). Trên môi trường CD bổ sung uridine, khuẩn lạc của chủng xóa gen có kích thước tương đương với chủng tự nhiên, tuy nhiên chủng xóa gen gần như không sinh bào tử (0,01% uridine) hoặc lƣợng bào tử đƣợc sinh ra rất ít (0,02% và 0,03% uridine) (Hình 3.10A). Trên môi trường CD bổ sung 0,01% uridine và 0,01%
61
uracil, chủng xóa gen sinh trưởng chậm hơn một chút so với chủng tự nhiên (Hình 3.10C). Khi bổ sung 0,02% uridine và 0,02% uracil, gần nhƣ không có sự khác biệt giữa kích thước của chủng đột biến xóa gen và chủng tự nhiên. Nhưng khi bổ sung 0,03% uracil và 0,03% uridine cả hai chủng tuy có kích thước tương đương nhau nhƣng lại phát triển chậm hơn khi ở nồng độ 0,02% uracil và 0,02% uridine (Hình 3.10C). Sự ức chế sinh trưởng khi nồng độ uracil quá cao cũng đã được Nguyễn Thị Khuyến và cộng sự báo cáo ở loài A. oryzae [78]. Như vậy, môi trường tối thiểu có bổ sung 0,02% uridine và 0,02% uracil là môi trường tốt nhất để phục hồi kiểu hình và khả năng sinh trưởng của chủng A. niger xóa gen pyrG.
3.3.3. Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil Chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens đã được chứng minh là phương pháp đơn giản, cho hiệu quả cao và áp dụng đƣợc với rất nhiều loài nấm sợi. Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố bao gồm: thời gian cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS), nồng độ bào tử, nhiệt độ và thời gian đồng nuôi cấy, nồng độ uridine/uracil trong môi trường cảm ứng... Với mỗi loài, cần một quy trình tối ƣu để đạt đƣợc hiệu suất chuyển gen mong muốn. Trong nghiên cứu này, một số thông số chuẩn áp dụng cho chuyển gen theo phương pháp ATMT vào nhiều loài nấm sợi đƣợc giữ nguyờn nhƣ nồng độ AS là 200 àM, thời gian nuôi cảm ứng 6 giờ, nhiệt độ đồng nuôi cấy 22°C… [69, 77]. Dựa trên kết quả về khả năng sinh trưởng của chủng A. niger xóa gen pyrG trên các môi trường có bổ sung nồng độ uridine, uracil khác nhau (Hình 3.10), chúng tôi lựa chọn bốn môi trường cảm ứng để tiến hành tối ưu quy trình chuyển gen là: IM + 0,02% uridine;
IM + 0,02% uracil, IM + 0,01% uridine + 0,01% uracil và IM + 0,02% uridine + 0,02% uracil. Hai nồng độ bào tử nấm đƣợc sử dụng chuyển gen là 105 và 106 bào tử/ml. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 mang vector pEX2A đƣợc sử dụng để tối ưu quy trình chuyển gen vào A. niger. Cấy một khuẩn lạc tươi của chủng vi khuẩn này vào môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin (100 mg/l), nuôi lắc qua đêm ở 28°C với tốc độ lắc 200 vòng/phút. Hút 1 ml dịch vi khuẩn cho vào 9 ml môi trường IM lỏng cú bổ sung AS (200 àM), bọc giấy bạc vào bỡnh vi khuẩn, nuụi lắc
62
ở 28°C, 200 vũng/phỳt trong 6 giờ sao cho OD đạt 0,6-0,8. Trộn 100 àl dịch vi khuẩn đó đƣợc cảm ứng với 100 àl dịch bào tử (nồng độ 105 và 106 bào tử/ml). Hỗn hợp này được trải đều trên màng cellulose đặt trên 4 loại môi trường cảm ứng bổ sung 200 àM AS, đồng nuụi cấy trong hộp tối ở 22°C trong 2,5 ngày. Sau đú màng cellulose được chuyển sang môi trường chọn lọc CD bổ sung cefotaxime (300 mg/l). Sau khi ủ đĩa 4 ngày ở 30°C, trên đĩa môi trường chọn lọc xuất hiện các khuẩn lạc nấm chuyển gen riêng rẽ, số lƣợng khuẩn lạc thu đƣợc trên 1 ml dịch bào tử đƣợc thể hiện trên Hình 3.11.
Hình 3.11. Kết quả tối ƣu quy trình chuyển gen vào chủng A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil
Các kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 3.11 cho thấy điều kiện nồng độ 106 bào tử/ml, môi trường cảm ứng IM bổ sung 0,02% uridine và 0,02% uracil cho kết quả cao nhất khi chuyển gen vào chủng A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil. Ở điều kiện này, số thể chuyển gen thu đƣợc là 2250 ± 200 thể chuyển gen/106 bào tử. Ở cùng điều kiện bổ sung nồng độ 0,02% uridine và 0,02% uracil nhƣng giảm nồng độ bào tử xuống còn 105 bào tử/ml, kết quả chuyển gen thu đƣợc là 1120 thể chuyển gen/ml bào tử, giảm xuống còn một nửa so với điều kiện ở trên. Ở những nồng độ
63
uridine/uracil còn lại, số lƣợng thể chuyển gen thu đƣợc thấp hơn rất nhiều. Đặc biệt ở nồng độ 0,02% uracil, kết quả chuyển gen thu đƣợc chỉ đạt 67 ± 15 thể chuyển gen/105 bào tử. Như vậy, môi trường IM bổ sung 0,02% uridine và 0,02 % uracil cùng với nồng độ 106 bào tử/ml là điều kiện tốt nhất để chuyển gen vào nấm sợi A.
niger trợ dƣỡng uridine/uracil. Quy trình chuyển gen tối ƣu đƣợc tóm tắt trong Hình 3.12.
Hình 3.12. Chuyển gen vào A. niger N402 trợ dƣỡng nhờ vi khuẩn A. tumefaciens, (A) Quy trình chuyển gen tối ƣu, (B) Minh họa các thể chuyển gen xuất hiện trên
đĩa môi trường tối thiểu, đối chứng sử dụng vi khuẩn không biến nạp vector Phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens đã được áp dụng thành công ở một số loài nấm sợi với hiệu suất cao nhƣ A. awamori (400 thể chuyển
64
gen/106 bào tử), Trichoderma reesei (10-20 thể chuyển gen/105 bào tử), A. oryzae (1060 ± 143 thể chuyển gen/106 bào tử) [69, 77, 105]. Phương pháp chuyển gen vào nấm sợi A. niger với marker pyrG bằng tế bào trần đã đƣợc thực hiện thành công với hiệu quả 400 khuẩn lạc/107 tế bào trần [38]. Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen bằng tế bào trần có nhiều hạn chế như chi phí cao, các bước thực hiện phức tạp đòi hỏi nhiều kinh nghiệm và hiệu suất không ổn định với mỗi lần thực hiện [59, 65]. Phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens có thể sử dụng trực tiếp bào tử nấm để chuyển gen, quy trình thực hiện đơn giản và cho hiệu quả chuyển gen cao, ổn định giữa các lần thực hiện khác nhau [39]. Quy trình chuyển gen tối ƣu vào chủng A. niger trợ dƣỡng uridine/uracil nhờ vi khuẩn A. tumefacines đƣợc thiết lập trong nghiên cứu này với hiệu quả cao, lên tới 2200 thể chuyển gen/106 bào tử, cao hơn rất nhiều so với phương pháp sử dụng tế bào trần (400 khuẩn lạc/107 tế bào trần). Quy trình chuyển gen tối ƣu vào A. niger sử dụng marker trợ dƣỡng pyrG đã mở ra triển vọng mới cho nghiên cứu biểu hiện enzyme và protein tái tổ hợp ở loài nấm sợi tiềm năng này.
3.3.4. Đánh giá hiệu quả chuyển gen huỳnh quang DsRed vào A. niger N402 trợ dƣỡng
Để xác nhận các khuẩn lạc thu đƣợc trên đĩa chuyển gen có nhận đƣợc gen chuyển, chúng tôi chọn ngẫu nhiên một vài khuẩn lạc cấy chuyển sang môi trường CD, sau đó tiến hành nuôi hệ sợi, tách chiết DNA và PCR xác nhận với hai cặp mồi DsRed-F/R và An-pyrG-P1/P2. Với cặp mồi An-pyrG-P1/P2, các thể chuyển gen lên 2 băng với kích thước lần lượt là 2,8 kb và 2,2 kb, đối chứng âm sử dụng DNA tổng số của A. niger đột biến trợ dƣỡng xóa gen pyrG lên băng 2,2 kb (Hình 3.13A).
Cặp mồi DsRed-F/R cho kết quả với các chủng chuyển gen là băng DNA có kích thước 730 bp tương ứng với kích thước của gen DsRed, đối chứng âm sử dụng DNA của chủng A. niger N402 xóa gen pyrG không xuất hiện băng nào (Hình 3.13B). Bên cạnh việc xác nhận chuyển gen bằng PCR, chúng tôi còn tiến hành quan sát hệ sợi của các chủng chuyển gen dưới kính hiển vi huỳnh quang. Kết quả cho thấy, hệ sợi và cuống sinh bào tử của các chủng đƣợc quan sát phát tín hiệu