Để xác nhận các thể chuyển gen, người ta cần đến sự trợ giúp của các marker chọn lọc. Marker chọn lọc giữ vai trò quyết định sự thành công của quá trình chuyển gen. Hai loại marker đƣợc sử dụng chủ yếu hiện nay là các gen kháng thuốc (gen kháng kháng sinh) và các gen liên quan đến sinh tổng hợp một hay nhiều hợp chất thiết yếu trong quá trình sinh trưởng của nấm.
Gen kháng kháng sinh
26
Có nhiều loại kháng sinh đƣợc sử dụng để chọn lọc thể chuyển gen ở nấm nhƣng thông dụng nhất là ba loại hygromycin B, phleomycin và nourseothricin.
Hygromycin B là một loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, đƣợc sinh ra bởi xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus. Kháng sinh này tiêu diệt đƣợc cả vi khuẩn, nấm và các sinh vật nhân chuẩn dựa trên cơ chế ức chế tổng hợp protein [83].
Phleomycin đƣợc sinh ra bởi xạ khuẩn Streptomyces verticillus, thuộc nhóm kháng sinh glycopeptide. Kháng sinh này hoạt động theo cơ thế bám vào DNA và phá vỡ cấu trúc sợi kép của DNA dẫn đến tế bào dừng các hoạt động và chết. Phleomycin có hiệu quả đối với hầu hết các loại vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, tế bào thực vật và tế bào động vật [64]. Kháng sinh nourseothricin có tên thương mại là clonNAT, là kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces noursei. Kháng sinh này gây lỗi mã hóa trong quá trình dịch mã khiến cho protein không đƣợc tổng hợp [51].
Gen kháng hygromycin B (hph) đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus 5 và vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) mã hóa cho HmB phosphotransferases bất hoạt hygromycin B theo cơ chế phosphoryl hóa. Gen kháng phleomycin (ble) đƣợc tìm thấy ở Streptoalloteichus hindustanus và E. coli mã hóa cho protein liên kết với kháng sinh và làm bất hoạt nó. Gen kháng nourseothricin (nat1) mã hóa cho nourseothricin acetyltransferase bất hoạt nourseothricin theo cơ chế acetyl hóa. Cả ba gen hph, ble, nat1 hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi làm marker chọn lọc thể chuyển gen ở vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và cả tế bào động- thực vật [51, 54, 86].
Phần lớn các nghiên cứu chuyển gen vào nấm sợi hiện nay sử dụng các loại gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc. Tuy nhiên, các loại kháng sinh này thường có giá thành rất đắt khiến chi phí cho các thí nghiệm tăng cao, gây hạn chế cho việc nghiên cứu chuyển gen. Bên cạnh đó, nhiều loại nấm sợi có khả năng kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ rất cao, tiêu biểu là A. oryzae khiến cho việc dùng gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc là
27
không khả thi [97]. Vấn đề này đã đƣợc khắc phục bằng cách cải biến di truyền của một số loài nấm sợi để có thể dùng các gen trợ dƣỡng làm marker chọn lọc.
Marker trợ dưỡng
Chủng đột biến trợ dƣỡng là những chủng không có khả năng tự tổng hợp một loại axit amin hoặc một hợp chất cần thiết cho sinh trưởng. Vì vậy các chủng này không thể sinh trưởng trên môi trường tối thiểu và yêu cầu bổ sung thêm axit amin hoặc hợp chất tương ứng. Các chủng đột biến trợ dưỡng được dùng để chuyển gen sử dụng marker chọn lọc là các gen trợ dưỡng tương ứng. Gen trợ dưỡng được sử dụng phổ biến nhất ở nấm sợi là pyrG. Gen pyrG mã hóa sinh tổng hợp orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (OMP decarboxylase), một enzyme quan trọng của quá trình sinh tổng hợp uridine và uracil cần cho sinh trưởng của nấm. Khi gen pyrG bị xóa hoặc bị đột biến gây hỏng, các thể đột biến sẽ không còn khả năng tổng hợp uridine (tiền chất của uracil). Do đó các chủng này sẽ không sinh trưởng được trên môi trường tối thiểu thiếu uridine/uracil. Khi gen pyrG được chuyển trở lại các chủng đột biến thì các chủng này lại có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường tối thiểu. Chính vì vậy, nhiều nghiên cứu đã sử dụng gen pyrG làm marker chọn lọc cho quá trình chuyển gen ở nấm [66, 89]. Ở các chủng tự nhiên (wild type), enzyme OMP decarboxylase sẽ chuyển hóa hợp chất 5-fluorooritic acid (5-FOA) không độc thành chất gây độc tế bào 5-flourouracil. Ngƣợc lại, ở các chủng đột biến sai hỏng gen pyrG sẽ không thể chuyển hóa 5-FOA nên chúng có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có bổ sung 5-FOA. Vì vậy 5-FOA thường được bổ sung vào môi trường trong quá trình sàng lọc các chủng vi nấm chuyển gen liên quan đến gen pyrG [106].
Đã có nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm tạo ra các chủng nấm sợi trợ dưỡng uridine/uracil. Phương pháp phổ biến nhất để tạo đột biến trợ dưỡng này là chiếu tia UV, sau đó sàng lọc trên môi trường chọn lọc có bổ sung 5-FOA, uridine và uracil [38, 46]. Các thể đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil còn đƣợc tạo ra bằng phương pháp xóa gen pyrG theo cơ chế trao đổi chéo tương đồng. Các vector xóa
28
gen pyrG đƣợc thiết kế và chuyển vào chủng nấm tự nhiên (wild type). Nhờ cơ chế trao đổi chéo tương đồng, gen pyrG nguyên gốc trong hệ gen của nấm có thể được thay thế bởi cấu trúc DNA tương đồng chuyển vào và mất đi khả năng hoạt động, từ đó hình thành chủng đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil [106].
Ngoài gen pyrG còn có các gen trợ dƣỡng khác cũng đƣợc sử dụng làm marker chọn lọc nhƣ gen adeA, met, trp, argB … Chuyển gen vào các chủng trợ dưỡng giúp giảm chi phí, an toàn đối với môi trường và có tiềm năng ứng dụng vào sản xuất thực tiễn [106]
1.5.2. Hệ thống marker chỉ thị dùng trong chuyển gen
Môi trường chọn lọc dùng cho chuyển gen thường gây chết hoặc kìm hãm sự phát triển của các chủng tự nhiên. Trong khi đó, các thể chuyển gen có thể phát triển bình thường do chứa các marker chọn lọc giúp bảo vệ chúng khỏi các yếu tố chọn lọc chuyển gen. Trái ngƣợc với marker chọn lọc, các marker chỉ thị chỉ làm thể chuyển gen có kiểu hình khác, dễ dàng phân biệt với chủng tự nhiên. Vì vậy, chúng đƣợc sử dụng nhƣ một dấu hiệu để sàng lọc các thể chuyển gen. Gen chỉ thị thường không gây ảnh hưởng đến chức năng sinh lý và khả năng sinh trưởng của các thể chuyển gen. Các gen chỉ thị có thể đƣợc biểu hiện cùng gen đích hoặc biểu hiện độc lập mà không cần gen đích đi kèm [7]. Gen chỉ thị gồm các gen mã hóa cho protein huỳnh quang hoặc các gen mã hóa cho các enzyme chuyển hóa cơ chất không nhìn thấy thành các chất có màu hoặc phát sáng. Các gen chỉ thị đƣợc dùng phổ biến trong chuyển gen là GFP, DsRed, GUS (mã hóa enzyme β-glucuronidase), LUC (mã hóa cho luciferase), LacZ (mã hóa -galactosidase), … Trong đó DsRed và GFP là hai gen chỉ thị đƣợc sử dụng nhiều nhất trong chuyển gen ở nấm sợi [52, 60, 75].
Gen mã hóa protein huỳnh quang xanh GFP
Gen GFP lần đầu tiên đƣợc Osamu Shimomura phân lập từ loài sứa Aequoreavictoria. Gen GFP có kích thước 720 bp, mã hóa cho protein kích thước 238 axit amin, trọng lượng 26,9 kDa. Protein này hấp thụ mạnh ánh sáng có bước
29
sóng 395 – 475 nm và phát ra tín hiệu huỳnh quang xanh lá khi đƣợc chiếu sáng dưới bước sóng 509nm (Hình 1.6) [85].
Hình 1.6. Biểu hiện gen huỳnh quang GFP ở nấm sợi A. oryzae [78]
DIC: ánh sáng thường. Fluorescence: ánh sáng huỳnh quang
Protein GFP cho tín hiệu huỳnh quang tốt dưới điều kiện chiếu tia UV hoặc ánh sáng huỳnh quang xanh mà không cần đòi hỏi cofactor hoặc cơ chất hoạt động nhƣ một số gen chỉ thị khác nhƣ β-glucuronidase, β-galacturonidase. Hơn nữa, sự tích hợp của gen GFP trong hệ gen tế bào chủ đủ bền vững đến các thế hệ sau nên gen chỉ thị GFP thường được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu chuyển gen và biểu hiện gen [60]. Đến nay, GFP đã đƣợc biểu hiện thành công ở nhiều loài sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn. Trong các nghiên cứu chuyển gen ở nấm sợi, gen GFP đã đƣợc biểu hiện ở một số loài nhƣ A. oryzae, A. niger, A. fumigatus, A. nidulans,
… [17, 33, 48, 78, 85].
Gần đây, một số dạng đột biến của gen GFP cũng đƣợc sử dụng nhƣ những chỉ thị sinh học phân tử. Chúng bao gồm các dạng đột biến BFP, CFP và YFP mã hóa cho các protein huỳnh quang phát ánh sáng xanh dương (blue), xanh lục (cyan) và vàng (yellow). Tuy nhiên, GFP vẫn là gen chỉ thị đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu chuyển gen và biểu hiện gen ở nấm sợi [60].
Gen mã hóa huỳnh quang đỏ DsRed
30
Gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed có chiều dài 687 bp đƣợc phân lập từ một loài san hô thuộc chi Discosoma mã hóa cho protein DsRed gồm 226 axit amin với kích thước 28 kDa. Protein DsRed phát ra tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh nhất dưới ánh sáng bước sóng 583 nm [11]. Với những tính chất tương tự như GFP, gen huỳnh quang đỏ DsRed đƣợc sử dụng làm chỉ thị phân tử ở nhiều loài sinh vật khác nhau. Ở nấm sợi, gen DsRed đã đƣợc biểu hiện thành công ở các loài nhƣ A.
oryzae, Fusarium oxysporum, Acremonium chrysogenum, A. fumigatus…[25, 44, 56, 76-78].
Hình 1.7. Biểu hiện gen DsRed ở chủng nấm sợi A. oryzae AUT1-PID [78]