Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Các kĩ thuật về sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu nhƣ PCR, tạo vector, xử lý enzyme giới hạn, lai (ligation), … đƣợc thực hiện tham khảo theo cẩm nang Molecular Cloning của tác giả Sambrook [91]. Các phương pháp như tách chiết DNA, tách chiết plasmid đƣợc phát triển bởi Phòng Genomic – Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội. Phương pháp như tinh sạch DNA sử dụng bộ kit tách chiết thương mại.
39 2.2.1. Thu bào tử nấm
Các chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường Czapek-Dox hoặc PDA.
Riêng với các chủng nấm trợ dƣỡng, 0,1% uracil và 0,1% uridine đƣợc bổ sung vào môi trường hỗ trợ sinh trưởng. Sau khoảng 3 ngày, các đĩa nuôi cấy trên sẽ được sử dụng để thu bào tử. Bổ sung nước cất vô trùng lên bề mặt đĩa nuôi và dùng que gạt vô trùng tách bào tử ra khỏi hệ sợi nấm. Dùng màng Miracloth (Calbiochem, Đức) vô trùng đặt trên miệng ống falcon vô trùng, dùng pipet hút dịch trên đĩa và cho qua màng lọc để loại bỏ hệ sợi. Phần dịch đi qua màng lọc sẽ đƣợc ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn. Phần cặn chứa bào tử nấm sẽ đƣợc rửa lại hai lần bằng nước cất vô trùng và ly tâm như trên để thu bào tử. Dịch bào tử sau khi thu xong sẽ đƣợc xác định nồng độ bằng buồng đếm Thoma. Pha loãng dịch này đến nồng độ 106 bào tử/ml. Giữ dịch bào tử này ở 4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Để lưu trữ lâu dài, dịch bào tử được bổ sung thêm glycerol đến 20%, làm đông nhanh trong nitơ lỏng và giữ ở -80oC. Đối với các chủng nấm trợ dƣỡng uridine/uracil, bào tử sau khi thu đƣợc cần kiểm tra để tránh nhiễm bằng cách nhỏ 20 - 50àl dịch bào tử trờn đĩa mụi trường tối thiểu Czapek-Dox (CD) và ủ đĩa khoảng 1 - 2 ngày ở 30ºC. Nếu hệ sợi nấm không xuất hiện, chứng tỏ bào tử là thuần khiết và đáp ứng đƣợc yêu cầu dùng cho chuyển gen.
2.2.2. Tách chiết DNA tổng số
Một mililit bào tử nấm (106 bào tử/ml) đƣợc bổ sung vào bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường CD lỏng. Bình được nuôi lắc với tốc độ 200 vòng/phút, ở 30ºC trong 3 ngày. Hệ sợi nấm đƣợc thu bằng cách lọc qua màng Miracloth và được thấm khô bằng giấy lọc trước khi chia vào ống eppendorf 2 ml. Sử dụng 200 mg sợi nấm nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn bằng cối chày sứ hoặc giã trực tiếp trong ống eppendorf sử dụng đũa thủy tinh. Bổ sung 600 àl đệm chiết GX (2,5% SDS; 200 mM Tris-HCl pH 8,0; 250 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0,2% β- mercaptoethanol) và 0,1 mg proteinase K vào ống. Vortex ống đều sau đó ủ ở nhiệt độ 60oC - 65ºC trong 30 phỳt. Bổ sung vào ống 300 àl natri acetate 3M (pH 5,2)
40
trộn đều và ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 20 phút ở 4ºC. Hút khoảng 700 àl dịch trong ở phớa trờn chứa DNA và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml, sau đú bổ sung thờm 700 àl isopropanol lạnh, trộn đều, ly tõm ở 12000 vũng/phỳt trong 20 phỳt ở 4ºC. Tủa chứa DNA đƣợc rửa bằng 500 àl ethanol 70%, ly tõm tốc độ 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4ºC và đƣợc làm khô bằng máy cô quay chân không SpeedVac trước khi hũa vào 50 àl đệm TE 1x (Tris-EDTA, pH 8). Bổ sung 2 àl RNase (10 mg/ml) và ủ ở 60ºC trong 30 phút để loại bỏ RNA. Sản phẩm DNA tổng số đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,7% và đƣợc bảo quản ở - 20ºC.
2.2.3. Thành phần của các phản ứng PCR
Trình tự các đoạn DNA đƣợc lấy từ GenBank hoặc từ cơ sở dữ liệu http://www.aspergillusgenome.org/. Các cặp mồi khuếch đại các trình tự DNA tương ứng được thiết kế trên phần mềm Primer3 và được tổng hợp hóa học bởi công ty IDT.
Đối với phản ứng PCR khuếch đại các đoạn gen sử dụng cho cắt nối tạo vector thì enzyme Phusion® high-fidelity DNA polymerase của hãng Thermo Scientific đƣợc sử dụng để đảm bảo độ chính xác của quá trình sao chép DNA.
Phản ứng PCR với tổng thể tớch 25 àl cú cỏc thành phần nhƣ sau:
Buffer 10x for Phusion : 2,5àl
dNTPs : 1àl
Mồi xuụi : 1àl
Mồi ngƣợc : 1 àl
Phusion polymerase : 1 àl
DNA khuụn : 1 àl
Nước vụ trựng : 17,5àl
Đối với phản ứng PCR nhằm mục đích kiểm tra thì sử dụng GoTaq Green MasterMix của hóng Promega với tổng thể tớch phản ứng là 5 àl gồm cỏc thành phần nhƣ sau:
41
MasterMix : 2,5àl
Mồi xuụi : 0,2 àl
Mồi ngƣợc : 0,2 àl
Nuclease free water : 1,9 àl
DNA khuụn : 0,2 àl
Các mồi sử dụng trong phản ứng PCR có nồng độ 10 pM.
2.2.4. Xử lý enzyme giới hạn
Cắt enzyme giới hạn:
Khung vector nhị thể trước khi nối các đoạn DNA cần thiết phải được xử lý với enzyme cắt giới hạn. Quy trỡnh cắt enzyme giới hạn với tổng thế tớch 20 àl gồm các thành phần nhƣ sau:
Vector : 4 àl
FastDigest buffer : 2 àl
Enzyme 1 : 1 àl
Enzyme 2 : 1 àl
Nuclease free water : 12 àl
Các thành phần trên đƣợc trộn đều trong ống eppendorf 1,5 ml, ủ ở 37oC trong 40 phút sau đó được điện di trên gel agarose, cắt băng DNA tương ứng và tinh sạch bằng kit để thu đƣợc phần khung vector đã xử lý enzyme.
Các đoạn DNA nối (Insert) cũng được xử lý với enzyme giới hạn tương thích theo quy trỡnh tương tự. Tổng thể tớch cắt 20 àl bao gồm cỏc thành phần:
Insert : 10 àl
Fast Digest buffer : 2 àl
Enzyme 1 : 1 àl
Enzyme 2 : 1 àl
Nuclease free water : 6 àl
42
Nối đoạn insert vào khung vector:
Khung vector và đoạn insert sau khi xử lý enzyme giới hạn sẽ đƣợc tiến hành lai ghộp (ligation). Thành phần phản ứng nối với tổng thể tớch 20 àl bao gồm:
Vector : 3 àl
Insert : 10 àl
T4 DNA ligase buffer 10X: 2 àl
T4 DNA ligase : 1 àl
Nuclease free water : 4 àl
Các thành phần phản ứng đƣợc trộn với nhau trong ống eppendorf 1,5 ml, bọc giấy bạc và ủ ở 4oC qua đêm sau đó biến nạp vào E. coli để phục vụ cho các bước tiếp theo của thí nghiệm.
Xử lý với enzyme làm bằng đầu:
Đối với tạo vector xóa pyrG yêu cầu sử dụng enzyme làm bằng đầu (DNA blunting enzyme cú trong bộ kit CloneJET PCR Cloning Kit), tổng thể tớch cắt 20 àl bao gồm :
2x reaction buffer : 10 àl
Vector pKO2 : 5 àl
Nuclease free water : 3 àl
DNA blunting enzyme : 1 àl
Trộn các thành phần trên trong ống eppendorf 1,5 sau đó voltex nhanh và ly tâm 3 - 5 giây, ủ ở 70o C trong 5 phút. Giữ ống eppendorf trên đá lạnh, bổ sung thờm 1 àl T4 ligase enzyme sau đú bọc giấy bạc ủ ở 4oC qua đờm.
Cắt kiểm tra vector
Bước cuối cùng của quá trình tạo vector là cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn. Mỗi vector sẽ đƣợc cắt kiểm tra bằng một hoặc hai, ba enzyme có trình tự nhận biết trên khung vector và trong đoạn insert. Quy trình cắt enzyme kiểm tra tương tự
43
với quy trỡnh cắt enzyme tạo vector. Tổng thể tớch cắt enzyme kiểm tra 10 àl với các thành phần:
Vector : 10 àl
FastDigest buffer : 1 àl
Enzyme 1 : 1 àl
Enzyme 2 : 1 àl
Nuclease free water : 1 àl
Sản phẩm cắt enzyme sau khi ủ ở 37o C trong 40 phút sẽ đƣợc điện di để kiểm tra kết quả.
2.2.5. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen
Tạo vector xóa gen pyrG ở A. niger
Gen pyrG đƣợc khuếch đại bằng PCR với khuôn là DNA hệ gen từ chủng A.
niger N402 với cặp mồi An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2) có trình tự nhận biết của enzyme giới hạn XbaI. Phản ứng PCR sử dụng enzyme Phusion® high-fidelity DNA polymerase với chu trình nhiệt như sau: 94ºC/ 6 phút; 35 chu kỳ lặp lại các bước 94ºC/ 30 giây, 58ºC/ 30 giây, 72ºC/ 2 phút; 72ºC/ 10 phút, giữ ở 4ºC.
Cấu trúc xóa gen pyrG ở A. niger đƣợc thiết kế dựa trên khung của vector nhị thể pKO2. Đoạn pyrG sau khi tinh sạch đƣợc cắt bởi enzyme XbaI, tiếp đó đƣợc nối vào vector pKO2 đã đƣợc cắt bằng 2 enzyme EcoRV và XbaI. Việc ghép nối sử dụng enzyme T4 DNA ligase theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Cấu trúc xóa gen pyrG đƣợc tạo bằng cách cắt vector mang gen pyrG nguyên gốc bằng 2 enzyme giới hạn là EcoRV và BamHI, sau đó tiến hành làm bằng đầu và ghép nối để vector tự đóng vòng bằng enzyme blunting có trong bộ kit ClonJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Cấu trúc xóa mang đoạn gen pyrG có kích thước nhỏ hơn gen pyrG nguyên gốc là 564 bp.
Tạo vector biểu hiện gen huỳnh quang đỏ pEX2A
44
Cấu trúc vector pEX2A đƣợc thiết kế dựa trên khung của vector nhị thể pEX2 mang gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed và marker chọn lọc là gen pyrG của A. niger.Vector pEX2 đƣợc cắt bởi hai enzyme EcoRI và SpeI, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel 0,7% trong 30 phút ở 90V, cắt lấy đoạn gel có chứa băng DNA kích thước 8,1 kb, tinh sạch đoạn DNA khung vector bằng kit tinh sạch DNA từ gel agarose theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Gen pyrG được PCR từ DNA tổng số, sau đó đƣợc cắt bằng enzyme EcoRI và XbaI và tinh sạch. Đoạn pyrG sau khi tinh sạch đƣợc nối vào khung vector pEX2 bằng enzyme T4 DNA ligase theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Vector sau khi tạo được cắt kiểm tra bằng enzyme XhoI, theo tính toán lý thuyết thì sản phẩm cắt sẽ gồm ba băng DNA với kích thước tương ứng là 1,28 kb; 2,35 kb và 8,29 kb.
Tạo vector biểu hiện huỳnh quang đỏ pEX2C
Cấu trúc vector pEX2C cũng đƣợc thiết kế dựa trên khung vector nhị thể pEX2 để biểu hiện gen DsRed dưới sự điều khiển của promoter glaA từ A. niger và marker chọn lọc là gen pyrG của A. oryzae. Sử dụng 2 enzyme SpeI và XhoI để cắt vector pEX2, sau đó điện di tinh sạch để thu đƣợc đoạn DNA khung vector kích thước 10 kb. Promoter glaA được PCR từ hệ gen của A. niger sử dụng enzyme Phusion high - fidelity DNA polymerase với chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC/ 6 phút;
35 chu kỳ lặp lại các bước 94ºC/ 30 giây, 58ºC/ 30 giây, 72ºC/ 1 phút; 72ºC/ 10 phút, giữ ở 4ºC. Promoter glaA sau đó đƣợc cắt bởi 2 enzyme SpeI, XhoI và tinh sạch bằng kit tinh sạch DNA. Đoạn glaA sau khi tinh sạch đƣợc nối vào khung vector pEX2 bằng enzyme T4 DNA ligase theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Vector sau khi tạo thành đƣợc cắt kiểm tra bằng enzyme EcoRI sẽ cho kết quả theo tính toán lý thuyết là 2 băng với kích thước là 2,22 kb và 8,4 kb.
2.2.6. Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Biến nạp vector vào vi khuẩn A. tumefaciens
Vector được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Khuẩn lạc tươi chủng AGL1 được nuôi lắc trong môi trường LB lỏng qua
45
đêm, 200 vòng/phút ở 28°C. Thu tế bào vi khuẩn bằng ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Rửa tế bào vi khuẩn ba lần bằng 10 ml HEPES 100 mM lạnh và một lần bằng glycerol 10%. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C giữa mỗi lần rửa. Hũa cặn tế bào trong 1 ml glycerol 10%. Chia 50 àl dịch tế bào AGL1 khả biến vào các ống eppendorf, làm đông nhanh trong nitơ lỏng và bảo quản ở -80°C. Khi biến nạp; trộn 0,5 àl plasmid vào 50 àl dịch tế bào khả biến, chuyển hỗn hợp vào cuvet 2 mm. Quá trình biến nạp đƣợc thực hiện bằng máy chuyển gen xung điện Bio-Rad với cỏc thụng số 2,5 kV, 400Ω, 25 àF. Sau khi kớch hoạt xung điện, bổ sung 500 àl mụi trường LB lỏng vào cuvet, trộn nhẹ và chuyển hỗn hợp sang ống eppendorf. Nuôi lắc 200 vòng/phút ở 28°C trong 1 giờ. Ly tâm thu tế bào ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 20 giây, cấy trải lên môi trường LB có bổ sung kanamycin (100 mg/l). Ủ đĩa ở 28°C, 2 - 3 ngày để thu đƣợc các khuẩn lạc kháng kanamycin.
Các khuẩn lạc đƣợc kiểm tra bằng colony PCR (PCR sử dụng khuẩn lạc làm DNA khuôn) với mồi đặc hiệu để xác nhận vi khuẩn AGL1 đã nhận đƣợc vector mong muốn.
Chuyển gen vào nấm bằng vi khuẩn A. tumefaciens
Cấy một khuẩn lạc tươi đã được xác nhận bằng PCR từ đĩa LB có bổ sung kanamycin vào 20 ml LB lỏng, nuôi lắc qua đêm ở 28°C với tốc độ 200 vòng/phút.
Hút 1 ml dịch nuôi cho vào bình tam giác có chứa 9 ml môi trường cảm ứng IM có bổ sung 200 àM AS, bọc giấy bạc để trỏnh ỏnh sỏng. Nuụi lắc ở 28°C, 200 vũng/phỳt trong 5 - 6 giờ, cho tới khi OD của dịch nuụi đạt 0,6 đến 0,8. Trộn 100 àl dịch nuụi đó cảm ứng với 100 àl bào tử nấm (nồng độ 106 bào tử/ml) rồi trải đều lờn màng cellulose đó được đặt sẵn trờn đĩa mụi trường IM cú bổ sung 200 àM AS.
Đồng nuôi cấy trong hộp tối trong 2,5 ngày ở 22°C. Sau đó chuyển màng cellulose sang đĩa môi trường chọn lọc CD có bổ sung kháng sinh cefotaxime (300 mg/l) tác dụng diệt vi khuẩn A. tumefaciens AGL1. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 3 - 5 ngày để nhận đƣợc khuẩn lạc chuyển gen.
46
Đối với thớ nghiệm xúa gen pyrG, 100 àl dịch nuụi đó cảm ứng đƣợc trộn với 100 àl bào tử nấm (107 bào tử/ml) rồi trải đều lờn màng cellulose đó đặt sẵn trờn mụi trường IM bổ sung 200 àM AS. Đồng nuụi cấy trong hộp tối 2,5 ngày trong 20°C. Sau đó chuyển màng sang đĩa môi trường chọn lọc Czapek-Dox (CD) bổ sung 0,1% uracil; 0,1% uridine; 0,2% 5-FOA và kháng sinh cefotaxime (300 mg/l).
2.2.7. Sàng lọc các thể chuyển gen
Sau khi thu được các thể chuyển gen riêng rẽ trên đĩa môi trường chọn lọc, các chủng này được thuần khiết bằng phương pháp cấy ria ba pha. Sau khi nuôi cấy và tách chiết DNA, các thể chuyển gen sẽ được xác nhận bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Xác nhận các thể xóa gen pyrG
Đối với các thể đột biến xóa gen pyrG, các khuẩn lạc nấm xuất hiện trên môi trường chọn lọc có 5-FOA sẽ được cấy chuyển đồng thời lên môi trường CD + 0,1% uracil + 0,1% uridine, CD + 0,1% uracil + 0,1% uridine + 0,2% 5-FOA và môi trường CD không bổ sung uridine và uracil để kiểm tra khả năng sinh trưởng.
Các chủng xóa gen pyrG không sinh trưởng được trên môi trường CD không bổ sung uridine, uracilvà sinh trưởng được trên môi trường có 5-FOA. Ngược lại, chủng tự nhiên sinh trưởng được trên môi trường không bổ sung uridine, uracil, nhưng bị ức chế trên môi trường có 5-FOA. Các chủng kháng 5-FOA được nuôi cấy và tách chiết DNA tổng số sau đó đƣợc PCR xác nhận với 3 cặp mồi đặc hiệu An- pyrG-P1/P2, An-pyrG-ORF-F/R và An-pyrG-ORF-F/An-pyrG-P3 (Bảng 2.2).Các thể chuyển gen được xác nhận xóa gen thành công khi kích thước của sản phẩm PCR nhỏ hơn 564 bp so với kích thước của đoạn pyrG nguyên gốc được PCR từ DNA tổng số của chủng nấm A. niger N402.
Xác nhận các thể chuyển gen sử dụng vector pEX2A
Các thể chuyển gen sử dụng vector pEX2A đƣợc nuôi cấy, thu hệ sợi và tách chiết DNA tổng số sau đó PCR xác nhận với hai cặp mồi là An-pyrG-P1/P2và DsRed-F/R. Với cặp mồi An-pyrG-P1/P2, các thể chuyển gen thành công của chủng
47
A. niger N402 trợ dưỡng uridine/uracil sẽ cho sản phẩm là 2 băng DNA kích thước 2,78 và 2,2 kb tương ứng với kích thước gen pyrG nguyên gốc và gen pyrG của chủng trợ dƣỡng. Kết quả xác nhận chuyển gen của hai chủng A. oryzae VS1, RIB40 trợ dưỡng uridine/uracil cho 1 băng với kích thước 2,78 kb tương ứng với kích thước gen pyrG của A. niger. Với cặp mồi DsRed-F/R, các cá thể chuyển gen của cả 3 chủng N402, VS1, RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil sẽ cho sản phẩm với kích thước 730 bp tương đương với kích thước của gen mã hóa huỳnh quang đỏ DsRed.
Xác nhận các thể chuyển gen sử dụng vector pEX2C
Đối với các thể chuyển gen sử dụng vector pEX2C, sau khi tách chiết DNA tổng số, DNA sẽ đƣợc sử dụng làm khuôn cho các phản ứng PCR xác nhận với 2 cặp mồi An-glaA-pro-F/R và DsRed-F/R. Kết quả thu đƣợc với cặp mồi An-glaA- pro-F/R là băng DNA với kích thước 600 bp, tương ứng với kích thước promoter glaA của A. niger. Kết quả PCR với cặp mồi DsRed-F/R cho băng DNA có kích thước bằng với kích thước gen DsRed-730 bp.
Xác nhận các thể chuyển gen huỳnh quang DsRed
Tất cả các thể chuyển gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed sẽ đƣợc tiến hành làm tiêu bản quan sát biểu hiện dưới kính hiển vi huỳnh quang. Đặt một miếng giấy thấm vào đĩa petri, đặt hai chiếc tip 1000 àl lờn trờn miếng giấy, đặt lam kính lên trên hai chiếc tip và để lamen ở trên giấy thấm. Đĩa đƣợc khử trùng ở điều kiện 121°C, 1 atm, 15 phút. Sau khi khử trùng, thêm nước cất vô trùng vào miếng giấy thấm để duy trì độ ẩm cho tiêu bản. Nhỏ một giọt môi trường thạch PDA/CD lờn trờn lam kớnh. Đợi giọt thạch đụng, nhỏ 10 àl dịch bào tử nấm lờn trờn giọt thạch, đậy lamen lại. Tiêu bản đƣợc ủ ở 25°C trong 1,5 ngày, sau đó tiêu bản đƣợc quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
48