3.5. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed dưới sự kiểm soát của promoter glaA từ A
3.5.2. Biểu hiện gen DsRed dưới sự kiểm soát của promoter glaA thông qua
Vector pEX2C sau khi tạo thành đươc biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens theo phương pháp biến nạp xung điện. Sau 3 - 4 ngày cấy trải trên môi trường LB bổ sung kanamycin (100mg/l), chúng tôi thu đƣợc một số khuẩn lạc đơn. Bốn khuẩn lạc ngẫu nhiên đƣợc lựa chọn PCR với cặp mồi An-pro-glaA-F/R (Bảng 2.2). Kết quả cho thấy, tất cả các khuẩn lạc được chọn đều lên băng DNA có kích thước 600 bp tương ứng với kích thước promoter glaA của nấm sợi A. niger. Đối chứng dương sử dụng vector pEX2C cũng cho băng DNA kích thước 600 bp. Đối chứng âm sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens không mang vector pEX2C không lên băng DNA nào (Hình 3.20).
74
Hình 3.20. Kết quả PCR kiểm tra 4 khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector pEX2C theo thứ tự Ag1, Ag2, Ag3, Ag4. Đối chứng (-) sử dụng vi khuẩn AGL1 không mang
vector pEX2C. Đối chứng (+) sử dụng vector pEX2C
Nhƣ vậy tất cả các khuẩn lạc vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 đƣợc chọn đã nhận đƣợc vector pEX2C.
Chọn một khuẩn lạc đã kiểm tra để nuôi cấy và tiến hành chuyển gen vào hai chủng nấm mốc A. niger N402 và A. oryzae VS1 trợ dƣỡng theo các quy trình đã thiết lập ở trên. Sau 3 - 5 ngày chuyển màng, trên đĩa môi trường chọn lọc xuất hiện các thể chuyển gen mọc riêng rẽ. Trong khi đĩa đối chứng sử dụng vi khuẩn A.
tumefaciens không mang vector pEX2C không xuất hiện thể chuyển gen nào ở cả hai chủng (Hình 3.21).
Hình 3.21. Chuyển gen DsRed sử dụng vector pEX2C mang marker pyrG từ A.
oryzae vào cả A. niger N402 và A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil
75
Các thể chuyển gen DsRed của chủng A. niger N402 đƣợc chọn lọc trên đĩa mụi trường CD bổ sung khỏng sinh cefotaxime (300 àg/ml) để diệt vi khuẩn A.
tumefaciens. Chuyển gen vào chủng N402 trợ dƣỡng uridine/uracil với nồng độ 106 bào tử/ml chúng tôi thu đƣợc 57 - 81 thể chuyển gen/đĩa. Trong đó, một số thể chuyển gen của chủng A. niger N402 có màu hồng ngay trên đĩa chọn lọc. Thể chuyển gen của chủng VS1 được chọn lọc trên môi trường M + Met bổ sung cefotaxime (300 àg/ml). Kết quả chuyển gen vào chủng A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil thu đƣợc 6 - 8 thể chuyển gen/đĩa.
Các thể chuyển gen N402::DsRed sẽ đƣợc xác nhận bằng ba phản ứng PCR độc lập sử dụng 3 cặp mồi AopyrG-ORF-F/R, An-glaA-pro-F/R và DsRed-F/R. Với cặp mồi AopyrG-ORF-F/R, các thể chuyển gen lên băng xấp xỉ 900 bp tương ứng với kích thước khung đọc mở gen pyrG của A. oryzae (Hình 3.22A). Với cặp mồi An-glaA-pro-F/R các thể chuyển gen cho băng tương ứng với kích thước đoạn promoter glaA 600 bp (Hình 3.22C). Với cặp mồi Dsred-F/R, kết quả thu đƣợc ở các thể chuyển gen là băng DNA với kích thước 730 bp bằng với kích thước gen DsRed (Hình 3.22B). Đối chứng âm sử dụng DNA của chủng N402 trợ dƣỡng, kết quả điện di không cho băng nào. Khi quan sát dưới ánh sáng huỳnh quang, toàn bộ hệ sợi và bào tử của các thể chuyển gen phát ra tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh (Hình 3.22D). Như vậy, gen DsRed dưới sự điều khiển của promoter glaA đã được chuyển thành công vào A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil.
76
Hình 3.22. Biểu hiện gen DsRed ở chủng nấm A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil. (A, B,C) PCR xác nhận gen pyrG, DsRed và glaA ở bốn chủng chuyển gen N1, N2, N3, N4. M: Marker DNA 1kb. Đối chứng (+) sử dụng vector
pEX2C, đối chứng (-) sử dụng nước cất vô trùng, (D) Hệ sợi nấm của các thể chuyển gen dưới ánh sáng huỳnh quang
Các thể chuyển gen của chủng VS1 cũng đƣợc tiến hành xác nhận bằng PCR với hai cặp mồi An-glaA-pro-F/R và DsRed-F/R. Kết quả PCR ở tất cả chủng chuyển gen đều cho băng DNA tương ứng với kích thước của promoter glaA (600 bp) và gen DsRed (730 bp) (Hình 3.23A). Hệ sợi của các thể chuyển gen khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang cho tín hiệu huỳnh quang đỏ rất mạnh (Hình 3.23D). Hơn nữa, các thể chuyển gen của chủng VS1 khi cấy trên môi trường CD có bổ sung 1% tinh bột, mặt sau của hệ sợi có màu hồng nhạt đến đậm (Hình 3.23C). Điều này có thể giải thích là do promoter glaA điều khiển hoạt động của gen DsRed là một promoter cảm ứng. Khi môi trường có bổ sung tinh bột, maltose sẽ cảm ứng hoạt động của promoter này khiến cho gen DsRed đƣợc biểu hiện mạnh, thậm chí dẫn đến kiểu hình đỏ có thể quan sát bằng mắt thường. Như vậy, có thể kết luận gen huỳnh quang đỏ DsRed dưới sự kiểm soát của promoter glaA của A. niger biểu hiện tốt ở chủng nấm A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil.
77
Hình 3.23. Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil.
(A,B) Xác nhận bằng PCR gen DsRed và glaA ở 4 chủng chuyển gen V1, V2, V3, V4, (C) Hệ sợi của các chủng chuyển gen có màu hồng khi nuôi cấy trên môi trường CD bổ sung 1% tinh bột, (D) Hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử phát tín hiệu
huỳnh quang đỏ khá tốt khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang
Promoter glaA đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là đoạn promoter của gen glaA mã hóa cho enzyme glucoamylase A của A. niger. Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng, glaA là một promoter cảm ứng, hoạt động mạnh khi môi trường nuôi cấy có bổ sung tinh bột, glucose, maltose và bị ức chế biểu hiện khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy xylose [28, 29, 95]. Promoter glaA đã được đưa vào nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp và đã đƣợc sử dụng nhƣ một chiến lƣợc trong công nghiệp sản xuất enzyme từ A. niger, A. oryzae và một số loài Aspergillus khác.
Promoter glaA đã đƣợc sử dụng để biểu hiện thành công gen GFP ở A. niger sử dụng phương pháp chuyển gen bằng tế bào trần [33]. Trong nghiên cứu này, promoter glaA đƣợc sử dụng thay cho promoter gpdA cho kết quả biểu hiện gen cao
78
ở cả hai loài nấm sợi A. niger và A. oryzae. Đây là lần đầu tiên, gen DsRed dưới sự điều khiển của promoter glaA từ A. niger đƣợc biểu hiện thành công ở A. oryzae và A. niger bằng phương pháp ATMT. Kết quả này một lần nữa chứng minh khả năng hoạt động của promoter glaA ở các loài khác trong chi Aspergillus. Gen chỉ thị huỳnh quang đỏ DsRed trong vector tạo đƣợc ở nghiên cứu này có thể đƣợc thay thế bằng các gen mã hóa cho enzyme hoặc protein mong muốn nhằm tăng cường biểu hiện gen dưới sự điều khiển của promoter glaA. Thêm vào đó kết quả chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium sử dụng vector pEX2C mang marker pyrG của A.
oryzae cũng cho kết quả ấn tƣợng với chủng A. niger N402 (570 thể chuyển gen/106 bào tử) và chủng A. oryzae VS1 (70 thể chuyển gen/106 bào tử). Nghiên cứu này một lần nữa khẳng định khả năng hoạt động chéo của gen pyrG ở một số loài gần gũi trong chi Aspergillus. Việc sử dụng marker pyrG của A. oryzae làm marker trợ dƣỡng trong chuyển gen vào nấm sợi A. niger bằng vi khuẩn A. tumefaciens là hoàn toàn khả thi.
79