1.3.1 Một số quy trình chiết xuất tạo cao trong và ngoài nước
Để tạo ra cao chiết lá xoài có khá nhiều phương pháp, nhưng phương pháp được sử dụng nhiều nhất là kết tinh cao lá xoài trong dung môi phù hợp. Một số nghiên cứu tách chiết xuất cao lá xoài trong và ngoài nước đã áp dung như sau:
Qui trình của GS Glyzin viện Cây thuốc toàn liên bang thuộc Liên Xô cũ chiết xuất bằng aceton - nước, loại tạp chất bằng clorofrom rồi chiết lại bằng n- butanol. Cuối cùng tinh chế bằng dioxan. Trong nghiên cứu này, tác giả đã bước đầu kết luận hoạt chất chính trong cao lá xoài tạo khả năng kháng khuẩn và mangiferin và các hợp chất sinh học khác như flavonoids, polyphenolic, …
Giáo sư Nguyễn Viết Tựu (1996) đã chiết mangiferin tạo cao lá xoài theo quy trình: Bột lá khô sau khi làm sạch được chiết với dung môi nước nóng, ly tâm thu dịch chiết. Lên men thủy giải, dịch chiết kho có mặt các enzym thủy giải của bản thân dược và của nấm meo tiết ra sẽ phân giải mangiferin ở dạng hòa tan thành mangiferin tự do, không tan, tách khỏi dung dịch và lắng xuống dưới. Ly tâm, lấy tủa rửa sạch sẽ thu được mangiferin thô 80%. Mangiferin thô sẽ được tinh chế với cồn - H2O nóng, thu được mangiferin tinh khiết 98%.
Shashi Kant Singh và cộng sự chiết các hợp chất thiên nhiên từ vỏ và thân của M. Indica L. bằng ethanol sau đó tách và tinh chế mangiferin bằng phương pháp sắc kí hấp thụ theo quy trình: dược liệu Sau khi loại bỏ chất béo bằng cách chiết kiệt với ether dầu hỏa trong bình Soxhlet (60 - 80oC, 56h) được chiết kiệt với ethanol 95%
(56h). Dịch chiết được cô với áp suất giảm, thu được bột màu vàng. Sau đó, bột thu được, được hấp thụ lên cột silicagel (60 - 120mesh), nhồi cột bằng ether dầu hỏa, rửa giải bằng hỗn hợp CHCl3/MeOH (1:1) thu được mangiferin màu vàng nhạt.
S. Muruganandan và cộng sự cũng chiết cao lá xoài bằng ethanol theo quy trình tương tự nhưng tinh chế Mangiferin bằng phương pháp kết tinh. Dịch chiết ethnol thu được đêm cô đến áp suất thấp đến cắn, loại chất béo nhiều lần rồi hòa tan tiếp vào ethanol. Để ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần, thu tủa được bột màu trắng ở dạng
vô định hình. Sau đó, kết tinh lại nhiều lần trong hỗn hợp dung môi H2O - EtOAc, thu được mangiferin tinh khiết, độ tinh khiết được xác định bằng HPLC đạt 95,56%.
Trong những nghiên cứu gần đây, phương pháp chiết xuất với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (ultrasonic - assisted extraction) đã được phát triển để tách chiết các hợp chất thiên nhiên hiệu quả từ lá xoài. Những thông số như nồng độ ethanol, tỉ lệ dung môi-nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian chiết xuất được tối ưu hóa bằng cách thử nghiệm trên từng yếu tố và phương pháp bề mặt đáp ứng (response surface methodology - RSM). Điều kiện chiết xuất tối ưu hóa như sau: 44% ethanol, tỉ lệ dung môi - nguyên liệu 38:1, chiết trong thời gian 19,2 phút ở 60oC dưới 200W của bức xạ siêu âm. Với điều kiện tối ưu đó, năng suất chiết mangiferin là 58,46 ± 1,27 mg/g.
Các nhà khoa học đã nghiên cứu và sử dụng kĩ thuật chiết xuất với sự hỗ trợ của lò vi sóng (microwave assisted) để chiết mangiferin từ cao lá xoài Mangifera indica. Một nhà thiết kế Box - Behnken đã được sử dụng để đánh giá tác dụng của ba thông số: điện lò vi sóng, thời gian khai thác, và tỷ lệ dung môi-nguyên liệu (ml/g). Các thông số đã được tối ưu hóa như sau: năng lượng của lò vi sóng 900W, thời gian chiết xuất 5 phút, tỷ lệ dung môi - nguyên liệu 10ml/g. Với những thông số tối ưu đó, năng suất chiết mangiferin đạt 63,22%.
Pereira và Miereles (2007) đã nghiên cứu chiết xuất hoạt chất sinh học từ lá xoài bằng CO2 lỏng siêu tới hạn (SC - CO2) đạt sản lượng rất thấp, chỉ 1,00% SC - CO2
là một dung môi không phân cực, vì vậy việc bổ sung hợp chất có khả năng phân cực là cần thiết để nâng cao hiệu suất khi khai thác của các hợp chất phenolic. Fernandez - Ponce et al (2012) cho thấy việc bổ sung ethanol đã cải thiện năng suất của quá trình nhanh lên 4,2 - 8,2%, tuy nhiên khai thác ở áp suất 4Mpa, 100oC, 10g/phút và 3 giờ cho hiệu quả cao với hiệu suất 35%. Các bộ phận cơ bản của một thiết bị chiết suất siêu tới hạn: một bể chứa chất lỏng CO2, một ống làm mát để ngăn chặn CO2 bay hơi trong máy bơm, một máy bơm CO2 lỏng, một bộ trao đổi nhiệt để kiểm soát nhiệt độ CO2, một ống thu dịch chiết, một bộ trao đổi nhiệt để kiểm soát CO2 cộng với chất tan hỗn hợp vào bình phân tách. Tại phòng thí nghiệm quy mô
ngưng tụ và tái chế CO2 sau khi tách chiết là không cần thiết nhưng ở mức sản xuất công nghiệp là những yêu cầu thiết yếu.
1.3.2 Quy trình chiết cao lá xoài áp dụng trong báo cáo
Qua các nghiên cứu đã nêu trên, dù phương pháp trích ly bằng sóng siêu âm có thể trích ly với hiệu quả cao và thời gian nhanh hơn, nhưng để phù hợp với điều kiện thiết bị trong phòng thí nghiệm trường Đại học BRVT, ta chọn phương pháp trích ly ngâm dầm. Ưu điểm của phương pháp ngâm dầm là không đòi hỏi thiết bị phức tạp, dễ dàng thao tác với lượng mẫu lớn, ít mất công hơn, quá trình chiết được diễn ra liên tục.
Qua đó tôi xây dựng được quá trinh trích ly tạo cao chiết lá xoài phù hợp với điều kiện thí nghiệm tại phòng thí nghiệm trường Đại học BRVT:
Đầu tiên ta xử lý nguyên liệu bằng nhiều phương pháp và trích ly với dung môi thích hợp nhằm làm sạch nguyên liệu, tăng hiệu suất trích ly ngâm dầm. Sau đó ta ngâm dầm bột lá xoài với dung môi phù hợp để trích ly các hợp chất thiên nhiên có trong nguyên liệu. Cuối cùng là việc đuổi dung môi nhằm tăng nồng độ của cao chiết lá xoài và lấy mẫu vật thực hiện các công đoạn sau. Tuy nhiên, hiệu suất của cao chiết thu được còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung môi, thời gian, tỉ lệ, … Trong điều kiện của đồ án này, tôi sẽ khảo sát 4 yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly cao lá xoài. Bao gồm: loại dung môi, nồng độ dung môi, thời gian ngâm dầm và tỉ lệ nguyên liệu/dung môi.
1.3.3 Ảnh hưởng của dung môi, nồng độ dung môi :
Trong các hợp chất thiên nhiên, điển hình như nhóm flavonoids, polyphenolic,
…việc cô lập chất phức tạp hơn vì một hợp chất thiên nhiên thường có hai hay nhiều nhóm chức hoá học có tính phân cực khác biệt nhau. Do vậy chúng ta phải lựa chọn dung môi phù hợp dựa trên nguyên tắc chung là ‘các chất giống nhau sẽ hoà tan với nhau’ để giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh chất được dễ dàng hơn. Tuy nhiên dung môi không có tính chọn lọc cao. Các loại dung môi có độ phân cực khác nhau
có thể hoà tan các loại hợp chất giống nhau. Việc pha loãng dung môi có tác dụng tiết kiệm dung môi và thay đổi độ phân cực của dung môi.
1.3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ thể tích dung môi/khối lượng nguyên liệu và thời gian ngâm dầm :
Kĩ thuật ngâm dầm không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây. Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thuỷ tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hoà tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây. Đổ một lượng dung môi thích hợp và đậy kín. Sau một khoảng thời gian nhất định ta thu được dịch chiết. Tuy nhiên nếu để quá lâu cũng sẽ không làm tăng thêm hiệu suất, ngược lại còn gây mất thời gian nên ta phải khảo sát. Bên cạnh đó, dự lý thuyết là ô ngõm dầm nguyờn liệu ằ với một lượng sấp sấp bề mặt nhưng ta cũng phải khảo sát để tránh tình trạng lãng phí dung môi.